Tipp 80:
Einfache und effektive Aufreinigung von siRNA
Wir stellen unsere eigene siRNA durch DICER Behandlung von in vitro transkribierter dsRNA her. Für die Aufreinigung dieser siRNA bieten viele Firmen verschiedene und oft auch teure Kits an. Nach einigem Experimentieren haben wir nun unsere eigene Methode entwickelt, die effektiv und auch noch günstig ist. Wir verwenden dazu den RNeasy Kit von Qiagen. Dieser Kit ist zwar nicht für die Aufreinigung von so kleinen RNA-Stücken gemacht, lässt sich aber mit einem kleinen Trick wunderbar für die Reinigung von siRNA benutzen.
Hier unser Protokoll:
Probe: 100 µl siRNA aus DICER Reaktion
- Puffer RLT mit 1 % b-Mercaptoethanol versetzen und 100 µl (= ein Volumen) zu der siRNA geben.
- 100 µl Isopropanol (=ein Volumen) zugeben.
- Probe auf eine RNeasy Spin Säule geben und bei 14 000 g für 30 Sek. bei RT zentrifugieren. Bei diesem Schritt bindet die siRNA NICHT an die Säule, sondern bleibt im Durchfluss! Es werden jedoch noch unverdaute, größere dsRNA Stücke sowie evtl. vorhandene DNA template Spuren beseitigt, die bei der Transfektion der siRNA stören würden.
- Den Durchfluss mit 200 µl Isopropanol (= zwei Volumen) versetzen. Unter diesen hohen Alkoholkonzentrationen bindet nun auch siRNA an die RNeasy Säulen.
- Probe auf eine zweite RNeasy Spin- Säule geben und bei 14 000 g für 30 Sek. bei RT zentrifugieren.
- Säule mit 500 µl RPE Puffer (vorher mit 4 Volumina Ethanol versetzen) waschen und Durchfluss verwerfen.
- Schritt 6 wiederholen.
- Säule bei 14 000 g für 1 Min. bei RT zentrifugieren um Reste von RPE Puffer zu entfernen.
- Säule in ein sauberes Eppendorfgefäß überführen.
- 30 µl RNase-freies Wasser auf die Säule geben, eine Minute stehen lassen und zur Elution der siRNA die Säule bei 14 000 g für 2 Min. bei RT zentrifugieren.
Mit diesem Protokoll lassen sich natürlich auch synthetische siRNAs oder andere kleine RNA Stücke aufreinigen. Viel Erfolg!
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20 % TBE-Acrylamid Gel. Gezeigt sind die Probe vor der Aufreinigung (1), das Eluat der ersten Säule (2) sowie das Eluat der zweiten Säule (3). Die durch DICER erzeugte 21mer siRNA läuft knapp über dem 25 bp-DNA- Marker. Unverdaute dsRNA sowie Reste des DNA-Templates sind im oberen Teil des Gels zu sehen. Diese großen Stücke binden an die erste Säule und können von dieser eluiert werden (Bahn 2). Die siRNA bindet erst an die zweite Säule und kann von dieser in reiner Form eluiert werden (Bahn 3). |
Andreina Byrd und Carsten Watzl
Institut für Immunologie, INF 305, Universität Heidelberg
Letzte Änderungen: 10.05.2005
