Bändermodell von Affimer-Grundgerüsten
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Antikörper gehören zur molekularbiologischen Grundausstattung. Ohne sie sind Aufgaben wie spezifische Erkennung, Visualisierung, Inhibierung, Anreicherung von Zielmolekülen - in vivo oder in vitro - kaum denkbar. Derzeit kursieren circa 500.000 Antikörper auf dem Markt, wovon aber schätzungsweise 75 Prozent nicht so recht zu trauen ist. Unzureichende Charakterisierung, Stabilitätsschwächen und Batch-abhängige Qualitätsschwankungen von Antikörpern bereiten Forschern immer wieder Kopfzerbrechen und sabotieren ihre Experimente. Auch ist viel Geduld gefragt, bis Kaninchen, Maus und andere tierische "Antikörperproduzenten" endlich das richtige Serum liefern.
Für Ungeduldige und Tierschützer bieten Affimere, an denen ein hochkarätiges, multidisziplinäres Forscher-Team mehrerer britischer Universitäten schon seit 2010 werkelt, eine interessante Alternative. Affimere sind kleine Proteine, die Zielmoleküle spezifisch erkennen und daran binden. Als Basisstruktur für Affimere nutzte das Team sogenannte Adhiron-Gerüste (Scaffolds) aus synthetischen Proteinen für Peptid-Displays, deren Struktur die Gruppe bereits 2011 aufgeklärt hat.
Diese von Phytocistatin abgeschauten, etwa 90 Aminosäure-langen Peptide bilden vier Beta-Faltblätter, die durch „Loops“ miteinander verbunden sind. Durch Einbau zufälliger Peptidsequenzen in diese Loops entstehen Affimer-Bibliotheken. Je nachdem, wie sich die Loops falten, können sie sich wie Puzzleteile an ein Zielmolekül anschmiegen. Zusätzlich erlaubt ein optional angefügter Cystein-Rest die C-terminale Fusion an beliebige Tags.
Gegenüber Antikörpern punkten Affimere mit einer höheren Robustheit. Einerseits „überleben“ sie auch in sauren Milieus und denaturieren bei Hitze nicht so schnell. Andererseits sind sie dank fehlender Cystein-Gruppen vom Redoxzustand unabhängig, funktionieren also auch unter den im Cytosol herrschenden reduzierenden Bedingungen. Dass Affimere bei weitem nicht so klobig wie Antikörper sind, erleichtert nicht nur ihr Eindringen in lebende Gewebe, sondern gestattet auch schärfere Aufnahmen bei der höchstauflösenden Mikroskopie.
Wichtig ist aber zuallererst, dass Affimere in punkto Bindefähigkeit und Spezifität mit klassischen Antikörpern mithalten können. Die Forscher untersuchten deshalb in zwölf typischen Anwendungsbeispielen die Bindeeigenschaften von Affimeren und verglichen sie mit Antikörpern (eLIFE).
Hierzu immobilisierten sie die Zielmoleküle zunächst auf der Oberfläche magnetischer Kügelchen (Beads). In einem anschließenden Phagen-Display, den die Forscher mit den Zielmolekül-tragenden Beads und einer Affimer-Phagen-Bibliothek durchführten, erkannten einzelne Kandidaten (Phagemid-Klone) Andock-Muster in den Zielmolekülen. Sie banden damit indirekt auch an die Beads und konnten durch Waschen von dem übrigen Phagen-Schwarm getrennt und letztlich eluiert werden. Nach Vermehrung in E. coli führte die Gruppe mit diesem Phagen-Pool, der mit Affimer-Kandidaten angereichert war, zwei weitere Selektionsrunden durch.
Anschließend ermittelten die britischen Forscher mit einem Phagen-ELISA die Spezifität der zufällig herausgepickten Affimer-Kandidaten. Hierbei testeten sie 48 Kandidaten gleichzeitig, jeweils parallel mit den entsprechenden Kontrollen, in 96-Loch-Mikrotiterplatten und arbeiteten danach mit den heißesten Kandidaten weiter. Die Sequenzierung der auf diese Weise selektierten Affimere lieferte schließlich Informationen zu ihrer Struktur, diente aber auch dazu, Duplikate „rauszuschmeißen“.
Für welche biochemischen und zellbiologischen Assays sind Affimere geeignet? Diese Frage beantworteten die Forscher mit zwölf exemplarischen Zielmolekülen, darunter elf medizinisch relevante Proteine sowie ein nicht-Protein-Molekül (TNT), die typische biochemische oder zellbiologische Verfahren repräsentierten.
Bei der Auswahl ihrer „Case Studies“ zeigten sich die Briten völlig unerschrocken und gingen echte Herausforderungen an. Beispielsweise zeigten sie, dass ihre Affimere ziemlich homologe SH2-Domän-Proteine unterscheiden können, ein Rhodamin-Red-markiertes Affimer sich zur Visualisierung eines Tumormarkers (Tenascin C) in Mäusegewebe eignet und ein Alexa647-gelabeltes Affimer bei der höchstaufgelösten Mikroskopie von CHO-Zellen verlässlich und scharf endogenes HER4 (Human epidermal growth factor receptor 4) anzeigt. Zudem können die im Phagendisplay ermittelten Affimere TNT von chemisch ähnlichen (jeweils Ovalbumin-gekoppelten) Molekülen (zum Beispiel 2,3-DNT; TNBS) unterscheiden. Auch die Affinitäts-Histochemie und die spezifische Erkennung phosphorylierter Proteine (pAKT) funktioniert mit Affimeren.
Dank ihrer Robustheit und hohen Expressionsrate lassen sich Affimere mit beachtlichen Ausbeuten als rekombinante Proteine exprimieren: Durchschnittlich 83 Milligramm pro Liter Kultur mit einer Reinheit von 95 Prozent – das kann sich sehen lassen. Eine 50 Milliliter-Kultur liefert laut Autoren genug Material für die Proteinreinigung und zumindest eine der zwölf "Muster-Anwendungen".
Die Autoren sehen Affimere ergänzend zu Antikörpern, nicht als deren Ersatz. Manch einer dürfte aber, angesichts der beachtlichen Zeitersparnis und dem häufigen Ärger mit Antikörpern, gänzlich auf Affimere umsteigen: Zwölf Tage für die Phagenselektion, sieben für die Umklonierung in E.coli, und dann noch einige Tage für Expression und Aufreinigung – ein Kaninchen geht´s da viel ruhiger an.
Die Bioscreening Technology Group der Uni Leeds stellt bereits Affimere und Dienstleistungen bereit. Hilfreich sind die Links zu detaillierteren Informationen. Schematische Darstellungen, etwa des Phagen-Display-Ablaufs, machen die Affimer-Strategie auch für Neueinsteiger verständlich. Zwei Affimer-Scaffold-Typen hat das Team momentan im Visier. Beide sind für Phagendisplay-Bibliotheken geeignet, die man nach geeigneten Affimeren durchforsten kann. Die Forscher arbeiten zudem an weiteren Scaffolds, die für ihre Strategie geeignet sind. So steigt die Chance, für möglichst viele Zielmoleküle tatsächlich einen effizienten und selektiven Affimer-Bindepartner zu finden.
Andrea Pitzschke