Beim Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) – übrigens benannt nach dem deutschen Physikochemiker Theodor Förster – wird die Energie eines angeregten Donor-Fluorophors auf einen Akzeptor übertragen. Je kürzer die Distanz zwischen Donor und Akzeptor, desto höher ist die FRET-Effizienz.
Bei der Einzelmolekül-FRET werden aber nur relative Änderungen der FRET-Effizienz gemessen, mit denen man zum Beispiel die Konformationsänderung eines Moleküls vom offenen Zustand, mit niedriger FRET-Effizienz, zum geschlossenen, mit höherer FRET-Effizienz, erkennen kann. Wesentlich mehr Informationen würde man erhalten, wenn man die Abstände exakt messen könnte.
Ein Konsortium von Forschern aus 20 Laboren unter Federführung von Claus Seidel (Universität Düsseldorf), Thorsten Hugel (Universität Freiburg), Tim Craggs (Universität Sheffield) und Jens Michaelis (Universität Ulm) hat die Einzelmolekül-FRET soweit verfeinert, dass mit ihr präzise Abstandsmessungen möglich sind. Einheitliche FRET-Standard-Moleküle bringen unterschiedliche Gerätefabrikate auf einen gemeinsamen Nenner und ermöglichen absolute Abstandsmesswerte.
Die Entscheidung, DNA-Moleküle als FRET-Standards zu verwenden, fiel den Forschern nicht schwer: Doppelsträngige DNA-Stücke lassen sich schnell und kostengünstig herstellen und punktgenau mit FRET-Farbstoffen dekorieren. Zudem überstehen sie auch längere Transportstrecken ohne aufwändige Kühlung. Die DNA-FRET-Standards tragen Donor- beziehungsweise Akzeptor-Fluorophorgruppen (Alexa Fluor und Atto 550), die über C2- oder C6-Aminolinker mit Thymidinen auf gegenüberliegenden Strängen verknüpft sind. Die Abstände zwischen den Thymidinen sind strikt vorgegeben und betragen 23, 15 sowie 11 Basenpaare.
Die FRET-Standards wurden an die beteiligten Labore verschickt, die sie mit der Einzelmolekül-FRET vermessen sollten – die Labore wussten jedoch nicht, welche der verschiedenen FRET-Standards sie erhalten hatten. Frei diffundierende Proben wurden mittels Konfokal-Mikroskopie analysiert, an Oberflächen anhaftende mithilfe der Internen Totalreflexionsfluoreszenz-(TIRF)-Mikroskopie. In einer Schritt-für-Schritt-Anleitung wurde vorgegeben, wie die Vermessung und die anschließende Abstandsberechnung erfolgen sollte.
Die Daten der einzelnen Labore stimmten überraschend gut überein, trotz unterschiedlicher Instrumente und Laborbedingungen. Als geeignetes Fenster, in dem Entfernungen verlässlich bestimmt werden können, stellten sich 0,6 bis 1,6 sogenannte Förster-Radien (R) heraus, die je nach Farbstoffpaar, etwa 35 bis 80 Angstrom entsprechen. Damit ist die Einzelmolekül-FRET auf dem besten Weg, ein wichtiges Werkzeug für die Strukturanalyse von Biomolekülen zu werden.
Andrea Pitzschke
Hellenkamp B. et al. (2018): Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements – a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods, 15:669–676