Cas9 mit guideRNA und Ziel-DNA
Not macht erfinderisch. Das gilt auch für Bakterien. Werden diese von Viren angegriffen, fahren sie ihr CRISPR/Cas-Immunsystem hoch und schalten damit die DNA der Eindringlinge aus. Der bakterielle CRISPR-Locus kodiert alle Werkzeuge, die es dafür braucht – tracRNA, CRISPR-Array und eine Cas-Nuklease. Zwei der Nukleasen, Cas9 und Cas12a (alias Cpf1), haben sich im Labor als Gene Editing-Werkzeuge etabliert – mit unterschiedlichen Stärken und Schwächen. Cas12a-basierte Systeme neigen dank eines Kontrollschritts bei der Zielerkennung weniger zu Off-Target-Effekten. Dafür zerschneiden sie aber im Gegensatz zu Cas9 auch Einzelstrang-DNA (ssDNA).
2017 stießen Jillian Banfield und Jennifer Doudna mit ihren Mitarbeitern von der University of California in Berkeley auf eine weitere Cas-Nuklease in Grundwasser-Bakterien (Delta-Proteobakterien, Dpb), die sie CasX nannten. CasX (alias Cas12e) verhinderte die Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA, wenn sie zusammen mit einer crRNA gegen die Plasmid-DNA exprimiert wurde. Das roch förmlich nach einer weiteren Cas-Nuklease für das Gene Editing. Eine Gruppe um Doudna nahm CasX deshalb genauer unter die Lupe.
Auf dem zu CasX gehörenden CRISPR-Locus aus Cas-kodierender Sequenz, tracrRNA und CRISPR-Array, erinnert alles an die entsprechenden Cas9- oder Cas12a-Loci. Auffällig ist, dass nur die konservierte Nuklease-Domäne RuvC von CasX Ähnlichkeiten mit den RuvC-Domänen von Cas9 und Cas12a aufweist und zu etwa 16 Prozent mit diesen identisch ist. Mit knapp 1.000 Aminosäuren ist CasX deutlich kleiner als die beiden anderen Cas-Nukleasen.
Trotz dieser signifikanten Unterschiede funktioniert auch CasX als RNA-geleitete DNA-Endonuklease. Analog der klassischen CRISPR/Cas-Technologie lassen sich auch hier tracrRNA und crRNA zu einer handlichen sgRNA vereinen, welche CasX zur Ziel-DNA führt. Voraussetzung hierfür ist ein 20 Nukleotide langer Abschnitt auf der Ziel-DNA (Protospacer), mit dem sich die sgRNA paaren kann.
CasX schneidet beide Stränge der doppelsträngigen DNA (dsDNA) um etwa zehn Nukleotide versetzt – ähnlich wie ein Restriktionsenzym das klebrige Enden produziert. Das liegt daran, dass der Schnitt auf dem Nicht-Zielstrang (NTS) und dem Zielstrang (TS) 12 bis 14 beziehungsweise 22 bis 25 Nukleotide nach dem sogenannten Protospacer-Adjacent Motif (PAM) erfolgt. Die PAM-Sequenz von CasX ist TTCN, im Gegensatz zu NGG für Cas9.
CasX schneidet nur doppelsträngige DNA und ist auch für CRISPRi-Experimente geeignet, bei denen eine inaktive Cas-Nuklease durch Anlagerung an die Zielsequenz die Transkription blockiert. Doudnas Mitarbeiter tauschten hierzu drei Aminosäuren im aktiven Zentrum von CasX aus. Auch beim Genom-Editieren in Säugerzellen (HEK293T) funktionierte CasX wie gewünscht.
Und wie sieht es mit der Effizienz aus, verglichen mit dem Gold-Standard Cas9 aus Streptococcus pyogenes (SpCas9)? Bei Editier-Experimenten in HEK293T-Zellen mit GFP als Ziel-Reporter-Gen, schickte Doudnas Team CasX und Cas9 parallel ins Rennen. Hier zeigte sich, dass CasX nicht ganz so wirkungsvoll arbeitet wie Cas9 und nur etwa dreißig Prozent der Effektivität von SpCas9 erreicht. Dabei sollte man jedoch bedenken, dass SpCas9 in den letzten sechs Jahren beständig optimiert wurde.
Anschließend untersuchte die Gruppe die Struktur von CasX mit der Cryo-Elektronenmikroskopie. Hierzu verwendete sie einen ternären Komplex aus inaktiver CasX-Variante, sgRNA (122nt) sowie komplementärer dsDNA (30 bp). Neben Domänen, die auch in anderen Cas-Proteinen zu finden sind, tauchten in CasX neue Strukturelemente auf. Offensichtlich hatte hier die konvergente Evolution ihre Finger im Spiel.
Verblüffend ist, wie sich das CasX-Protein im Komplex dirigieren lässt. Mit nur 26 Prozent ist der Gewichtsanteil der sgRNA eher klein – dennoch gibt sie maßgeblich die Struktur des ternären Komplexes vor. Der kann prinzipiell zwei Konformationen annehmen, wodurch die Nuklease-Domäne Zugang zum Nicht-Zielstrang (Konformation I) oder zum Zielstrang (Konformation II) erlangt. Nähert sich der Komplex seinem Ziel, so schneidet die RuvC-Domäne zuerst auf dem Nicht-Zielstrang, wandert nach vollbrachter Arbeit weiter und zerschnippelt anschließend den Zielstrang.
Andrea Pitzschke
Liu J. et al. (2019): CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature, DOI: 10.1038/s41586-019-0908-x