Einzelmolekül-Analysen mit GFP-Fusionsproteinen sind relativ einfach durchzuführen, funktionieren aber vor allem in lebenden Systemen nicht immer wie gewünscht. Ein Problem ist, dass die fluoreszierenden Proteine nur eine begrenzte Anzahl an Photonen emittieren können, bevor das Licht sprichwörtlich ausgeht. Man muss also einen guten Kompromiss finden, zwischen präzisem lokalen Signal mit ausreichender Fluoreszenz-Intensität und der Beobachtungsdauer, die durch das Ausbleichen begrenzt ist.
Ein Weg die Beobachtungsdauer zu verlängern, sind Array-Tags, an die gleich mehrere Fluoreszenz-Proteine binden. Bei diesen verursacht ungebundenes GFP jedoch eine Hintergrund-Fluoreszenz, die das Signal-zu-Rausch-Verhältnis ziemlich ruinieren kann.
Ein interdisziplinäres Team um Jan Liphardt von der Stanford University hat einen neuen, verbesserten Array-Tag für Fluoreszenz-Proteine entwickelt, der mit dem GFP-Nano-Antikörper GBP1 besetzt ist und bis zu 24 Bindungsstellen für GFP bietet. Die Forscher fanden heraus, dass die Fluoreszenz von freiem monomeren Wildtyp-GFP zwar geringer ist als das üblicherweise eingesetzte stärker fluoreszierende eGFP (enhanced GFP). Wenn WT-GFP jedoch an GBP1 auf dem Array bindet, erfolgt eine Verstärkung der wtGFP-Fluoreszenz. Die Fluoreszenz-Stärke erreicht fast neunzig Prozent eines mit eGFP besetzten Arrays ohne Verstärkungseffekt.
Die Forscher testeten, wie sich die Verstärkung auf die Beobachtungsdauer mit einem (HiLo-TIRFM-)Mikroskop auswirkt. Dazu fusionierten sie den Array mit Integrin beta1 und konnten einzelne Moleküle bis zu 200 Sekunden in chemisch fixierten Zellen beobachten. Im Mittel lagen die Beobachtungsdauern bei etwa 44 Sekunden. Sie waren damit zehnmal länger als im Vergleichsexperiment mit beta1-eGFP, ohne GFP-Array. Selbst in lebenden Zellen, in denen Zell- und Molekülbewegungen die Beobachtung unter dem Mikroskop stören, erreichte die Gruppe immer noch Beobachtungsdauern von bis zu 105 Sekunden.
Da das Ausbleichen der GFP-Moleküle auch im Array-System für die Beobachtungsdauer limitierend sein müsste, schauten sich die US-Amerikaner die Bindungskinetik der GFP-Moleküle genauer an. In einem bestimmten kinetischen Bereich müsste sich ein Gleichgewicht zwischen Ausbleichen und Molekül-Austausch einstellen. Mit der richtigen Beleuchtungsfrequenz sollte es möglich sein, die Bleichrate zu kontrollieren und somit die Fluoreszenz dauerhaft zu erhalten.
Diese Annahme bestätigte das Team mit dem Histon H2B, das eine langsame Dissoziations-Kinetik zeigt. Regten Liphardts Mitarbeiter einen H2B-ArrayG mit einer niedrigen Frequenz an, blieb dieser dauerhaft mit leuchtenden GFPs besetzt und die Forscher konnten die Histone über eine Stunde lang beobachten.
Mit dem ArrayG ist es möglich, biologische Abläufe zu verfolgen, die auf einer Zeitskala von Sekunden bis Stunden ablaufen. Damit lassen sich zwar keine schnellen Zellprozesse beobachten, die nur wenige Millisekunden dauern. Für die Analyse langsamerer Dynamiken, die zum Beispiel bei der Translation, DNA-Spleißen oder dem Transport von Signalproteinen zwischen Zellkern und Cytosol auftreten, ist die Technik aber gut geeignet. Zudem kann man Molekül-Kinetiken und -dynamiken mit dem ArrayG mit einer bisher unerreichten statistischen Aussagekraft untersuchen.
Mit einer weiteren Array-Tag-Variante, die auf einem Dihydrofolatreduktase-Nano-Antikörper und dem Dihydrofolat-Reduktase-Fluorophorbinder basiert, der mit jedem beliebigen Fluorophor fusioniert werden kann, lassen sich sogar mehrfarbige Fluoreszenz-Signale gleichzeitig beobachten.
Das nächste Ziel des Teams aus Stanford ist die Anpassung des ArrayG-Systems für die Markierung von Genen.
Miriam Colindres
Ghosh R. et al. (2019): A fluorogenic array for temporally unlimited single-molecule tracking. Nature Chemical Biology, DOI:10.1038/s41589-019-0241-6