Um Gensequenzen mit CRISPR/Cas zu editieren, reicht es, wenn man einzelne Nukleotide modifiziert ohne sie ganz zu ersetzen. So wandeln zum Beispiel Cytidin-Deaminasen C zu U beziehungsweise C zu T um und Adenosin-Deaminasen machen aus einem A ein G. Ein umgebautes, von einer guideRNA geleitetes CRISPR/Cas-System bringt die Deaminasen zur gewünschten Ziel-DNA. Die Deaminase sitzt als Fusionsprotein huckepack auf einer Cas-Nickase, die anders als Wildtyp-Cas nur Einzel- und keine Doppelstrangbrüche induziert.
J. Keith Joungs Gruppe am Massachusetts General Hospital in Charlestown, USA beschäftigt sich schon länger mit Cytosin- sowie Adenin-Basen-Editoren (CBEs, ABEs) und nutzt sie, um Gensequenzen punktuell zu ändern. Dabei fiel ihr auf, dass CBEs und ABEs neben der Ziel-DNA, unabhängig von der guideRNA, auch RNA modifizieren. Diesen RNA-Off-target-Effekt beobachtete Joungs Team sowohl bei der häufig eingesetzten Cytidin-Deminase APOBEC1 aus Ratten (BE3), als auch bei der Adenosin-Deaminase TadA aus E. coli (ABEmax).
Joungs Mitarbeiter machten sich deshalb daran, treffsicherere Basen-Editoren zu kreieren. Anfang des Jahres stellten sie die ersten verbesserten Cytosin-Editoren SECURE-BE3 (SElective CUrbing of Unwanted RNA editing) in Nature vor. Inzwischen konstruierten sie auch einen zielsicheren Adenin-Editor (SECURE-ABE), den sie in einem Preprint-Paper auf biorxiv zur Diskussion stellen.
Auf der Suche nach SECURE-ABEs durchstöberte die Gruppe zunächst alte RNA-Seq-Daten und stieß dabei auf das Sequenzmotiv CUACGAA, das in modifizierten RNAs gehäuft auftrat. Das war kein Zufall, denn genau dieses Motiv sitzt im natürlichen tRNA-Substrat des E.coli-Enzyms TadA. Das in ABEmax eingesetzte TadA war einst durch gerichtete Evolution (directed evolution) des natürlichen Enzyms entstanden. Es ist ein Dimer aus der normalen TadA und einer TadA-Variante, die DNA-Adenine deaminiert. Joungs Gruppe vermutete, dass die Wildtyp-Untereinheit des TadA-Dimers für den starken RNA-Off-target-Effekt von ABEmax verantwortlich ist. Sie schmiss WT-TadA deshalb aus dem Adenin-Editor raus und speckte ihn zu dem monomeren miniABEmax ab.
Welche Auswirkungen dies auf den RNA-Off-Target-Effekt hatte, testete die Gruppe mit einem miniABEmax-Cas9-Nickase-Fusionsprotein, das sie zusammen mit einer gegen eine Ziel-DNA gerichtete gRNA in HEK293T-Zellen einschleuste. Als Vergleich diente die ursprüngliche ABEmax. Interessanterweise deaminierte miniABEmax die angepeilten Adenine auf der Ziel-DNA genauso effizient wie ABEmax, die fehlgeleitete Deaminierung von RNA-Nukleotiden war jedoch deutlich geringer. Ganz ausgemerzt war der RNA-Off-Target-Effekt aber noch nicht.
Bei der weiteren Optimierung von miniABEmax kamen den Forschern die bereits bekannten Kristallstrukturen der E. coli-Deaminase TadA sowie eines tRNA-TadA-Komplexes aus S. aureus zugute. Bei der Überlagerung der beiden Strukturmodelle fielen ihnen einige Abschnitte auf, die in E. coli-TadA potenziell für die RNA-Bindung verantwortlich sein könnten. Die Gruppe tauschte die Aminosäuren an den entsprechenden Positionen aus und erhielt 34 miniABEmax-Varianten, deren Adenin-Editier-Verhalten sie in HEK293-Zellen analysierte. Testsieger waren schließlich zwei SECURE-ABEs mit einer sehr starken gRNA-spezifischen DNA-Editierung und einer nochmals deutlich reduzierten RNA-Off-Target-Aktivität.
Andrea Pitzschke
Grünewald J. et al. (2019): Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature, 569: 433–437