Viele Proteine kommen erst in Fahrt, wenn sie posttranslational modifiziert werden. Hier eine zusätzliche Phosphatgruppe, da eine Glykosylierung und schon ändern sich ihre Eigenschaften. Die entsprechende Modifikation präzise und effizient an der gewünschten Stelle des Proteins unterzubringen, ist aber nicht so einfach. Je nach Protein und Art des Anhängsels verwendet man verschiedene Strategien, die meist auch Schwachpunkte haben, wie zum Beispiel begrenzte Einsetzbarkeit, niedrige Effizienz, (Ir)reversibilität, hoher Aufwand und unschöne „Ligationsnarben“.
Sehr raffiniert und einfach durchzuführen ist eine neue auf Split-Inteinen basierende Protein-Ligations-Technik, die sich Transpeptidase-Assisted Intein Ligation (TAIL) nennt. Entwickelt wurde sie von der Gruppe des Intein-Spezialisten Tom Muir von der Princeton University.
Inteine sind ziemlich ungewöhnliche Proteine beziehungsweise Protein-Domänen, die sich durch sogenanntes Protein-Splicing selbst aus ihrem „Wirts-Protein“ herausschneiden. Während dieses Prozesses verknüpfen sie die zurückbleibenden flankierenden N- und C-terminalen Reste (Exteine) durch eine Peptidbindung. In der Natur treten Inteine in einigen Fällen als zweigeteilte sogenannte Split-Inteine (Int n und Int c) auf, die getrennt exprimiert werden. Finden die Split-Inteine zusammen, werden sie aktiv und verbinden die mitgeschleppten N- und C-Exteine durch trans-Splicing.
Zu den Split-Inteinen gehört auch Cfa (consensus fast), das Muirs Gruppe durch Mutation eines DnaE-Inteins aus dem Cyanobakterium Nostoc punctiforme erhielt (J Am Chem Soc, 138(7): 2162–5). Im Gegensatz zur ziemlich trägen Reaktionskinetik natürlicher Inteine verläuft die durch Cfa vermittelte trans-Splicing-Reaktion sehr rasant. Theoretisch muss man nur ein gewünschte Protein an die Int n-Hälfte von Cfa und das gewünschte Label an die Int c-Hälfte hängen, um Protein und Label durch eine trans-Splicing-Reaktion zu verknüpfen. In der Praxis wird dies aber durch die Größe der beiden Hälften erschwert, die 35 beziehungsweise 101 Aminosäuren lang sind.
Die Gruppe hat für dieses Problem eine sehr smarte Lösung gefunden: Sie zerlegt die Split-Inteine und führt einen zusätzlichen Reaktionsschritt ein. Das neue Verfahren sieht dann so aus: Int c wird zunächst in zwei Stücken produziert. Das Fragment mit dem Label besteht nur aus sieben Aminosäuren, die aus dem Erkennungsmotif für die Transpeptidase Sortase bestehen und kann synthetisch hergestellt werden. Dem übrigen, verkürzten Int c (Intc-truncated) fehlt dieses kurze Stück. Mithilfe der Sortase werden die beiden zusammengebaut.
Anschließend erfolgt die trans-Splice-Reaktion, bei der Int n das zu labelnde Protein als Extein mitbringt. Et voilà, das Intein spaltet sich heraus und übrig bleibt das dekorierte Wunschprotein. Der Trick mit der Sortase funktioniert in beide Richtungen: Muirs Mitarbeiter schmuggelten das Erkennungsmotif für Sortase sowohl in Int n als auch in Int c ein, die Spleiß-Fähigkeit wurde dadurch nicht beeinträchtigt.
Die Sortase muss auch nicht separat als Enzym zur Reaktion zugegeben werden – sie wird einfach als Fusionsprotein an Int c-truncated angehängt. Überall, wo Int c-truncated herumschwirrt, ist die Sortase automatisch mit dabei, wodurch die Wahrscheinlichkeit, dass der Zusammenbau erfolgreich ist, steigt.
Das ganze ist jedoch keine reine In-vitro-Spielerei für Biotechnologen. Der Gruppe gelang es mit der Technik zum Beispiel, das Histonprotein H3 in zellulärem Chromatin zu biotinylieren.
Andrea Pitzschke
Thompson R. et al. (2019): Protein engineering through tandem transamidation. Nature Chemistry, DOI: 10.1038/s41557-019-0281-2