Die Konzentration eines Zielproteins in einem Proteinextrakt oder in einer Gewebeprobe bestimmt man häufig mit Western-Blots oder ELISAs. Die hierfür eingesetzten Antikörper erkennen das Zielprotein und senden danach quantifizierbare Signale aus. Western-Blots liefern wertvolle Zusatzinfos zur Proteingröße und zur Menge der parallel aufgetragenen Proben – sie sind aber nur schlecht skalierbar. Mit mehr als einer Handvoll Membranen beziehungsweise Polyacrylamidgelen pro Tag zu jonglieren, ist schwierig – die Probenanzahl hält sich also eher in Grenzen. ELISAs sind dagegen besser für den Hochdurchsatz geeignet, eine Normalisierung auf den Gesamt-Proteingehalt ist aber nicht möglich.
Forschern vom Georgia Institute of Technology and Emory in Atlanta um den Bioingenieur und Augenforscher Christopher Ross Ethier ist es gelungen, die Vorteile von Western-Blots und ELISAs zu kombinieren. Ihr FRANC-Assay (Flexible Robust Assay for Quantification and Normalization of Target Protein Concentration) erlaubt es, ein Zielprotein im Hochdurchsatz in einem Proteingemisch zu quantifizieren, und seine Menge intern auf den Gesamt-Proteingehalt zu normalisieren.
Wenig Gemeinsamkeiten
Wie bei Western-Blot und ELISA benötigt man auch für den FRANC-Assay spezifische Antikörper. Das war's dann aber schon mit den Gemeinsamkeiten. Bei FRANC koppelt man im ersten Schritt sämtliche Proteine einer Probe an magnetische Beads. Dazu inkubiert man den Proteinextrakt zwei Stunden mit Sulfo-NHS-LC-Biotin, wodurch Amingruppen und Ester kovalente Bindungen eingehen. Anschließend versetzt man die Mixtur mit hydrophoben Streptavidin-ummantelten magnetischen Beads. Nach dreißig Minuten haben die Beads das Gros der mit Biotin versehenen Proteinmoleküle eingefangen.
Nach einigen Waschschritten, die ungebundenen Unrat beseitigen, sind die Protein-beladenen Beads bereit für den nächsten Schritt. Bei diesem werden sie mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper inkubiert, der das jeweilige Zielprotein erkennt. Eine indirekte Markierung mit Primär-Antikörper und Fluoreszenz-gelabeltem Sekundär-Antikörper ist aber ebenfalls möglich.
Ein Bead, zwei Signale
Für die Normalisierung werden anschließend sämtliche an den Beads hängende Proteine mit dem Fluoreszenz-Farbstoff 4'-(Aminomethyl)fluorescein (AMF) markiert, der mithilfe eines Carbodiimid-Crosslinking-Reagenzes wahllos an freie Carboxylgruppen der Proteine andockt. Die Beads werden daraufhin noch einmal durch eine magnetische „Waschanlage“ geschickt (96- oder 384-Well-Format) und dann im Durchflusszytometer vermessen. Jedes Bead liefert zwei Signale: ein spezifisches vom Fluoreszenz-markierten Antikörper und eines von AMF, das den Gesamt-Proteingehalt angibt.
Ethiers Mitarbeiter testeten Proteinproben aus sechs verschiedenen Organismen mit dem FRANC-Assay, darunter mesenchymale Stammzell-Lysate sowie Seren von Kaninchen, Ziege und Maus. Die Ergebnisse verglichen sie mit dem für Protein-Quantifizierungen oft eingesetzten BCA-Protein-Assay. Der FRANC-Assay funktionierte hierbei genauso zuverlässig wie der BCA-Test. Er ist aber um einiges sensitiver: Mit direkt-markierten Primär-Antikörpern ließen sich zum Beispiel noch 60 Picogramm des Zielproteins aufspüren. Wurde ein sekundärer Antikörper verwendet, sank das Detektions-Limit sogar bis in den Femtogrammbereich.
Nicht mal drei Euro pro Probe
Und wie groß ist der Aufwand für den FRANC-Assay? Von der Probennahme bis zur Detektion vergehen etwa fünf bis sechs Stunden. Davon ist ungefähr eine Stunde Handarbeit. Für jede Probe sollte man eine Verdünnungsreihe anlegen, um sicherzustellen, im linearen Bereich unterwegs zu sein. Kostenpunkt für eine Probe mit zwölf Verdünnungsstufen: Deutlich weniger als drei Euro.
Andrea Pitzschke
Snider E. et al. (2020): A flexible, robust microbead-based assay for quantification and normalization of target protein concentrations. Analytical Biochemistry, 590:113510)
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