Die Western-Blot-Analyse ist in vielen molekularbiologischen sowie biotechnologischen Laboren Routine und liefert nicht nur qualitative, sondern auch quantitative Daten zur Expression von Proteinen. Leider lässt die Reproduzierbarkeit von Western-Blot-Daten häufig zu wünschen übrig. Das lässt sich vermeiden, wenn man die Richtlinien beachtet, die ein Team um Jeff Harford von der Firma LI-COR Biosciences für die Durchführung von Western Blots und der anschließenden Datenauswertung ausgearbeitet hat.
So einfach wie ein Western Blot im Grunde ist, gibt es dennoch viele Fehlerquellen. Schon kleinste Variationen bei der Durchführung des Blots oder scheinbar geringe und unbedeutende Unterschiede bei Reagenzien und Geräteeinstellungen können die Daten verfälschen. Und natürlich spielt auch die Erfahrung des Experimentators eine nicht zu unterschätzende Rolle. Harford und seine Mitarbeiter Lakshmi Pillai-Kastoori und Amy Schutz-Geschwender konzentrieren sich in ihrem Ratgeber auf fünf kritische Punkte. Auf diese sollte man beim Western Blot besonders achten, um gravierende Fehler zu vermeiden und reproduzierbare und genaue Ergebnisse zu erzielen.
Die Probe
Der erste Schritt ist ein kritischer Blick auf die Probe: Die Qualität der Daten kann nur so gut sein wie die Qualität der Probe. Um eine brauchbare Probe herzustellen, muss man eine Extraktions- und Reinigungsmethode wählen, die auf die Art und Herkunft des Zielproteins, zum Beispiel Kern-, Membran- oder Mitochondrien-Protein, zugeschnitten ist. Die verwendeten Protokolle sollten möglichst standardisiert sein und konsistent während der Gesamtdauer der Studie benutzt werden.
Der zweite Punkt ist die Probenmenge. Wie viel sollte für die Gelelektrophorese aufgetragen werden? Tendenziell gilt: Weniger ist mehr. Will man auf Nummer sicher gehen, kommt man um eine Kalibrierung nicht herum. Nur wenn man den linearen Korrelationsbereich für Probe und Signal kennt, in dem die Bandenstärke proportional zur Probenmenge zunimmt, kann man sich auf die Daten verlassen. Bewegt man sich über dem linearen Bereich, wird die Signalstärke unterschätzt; ist man unterhalb des linearen Bereichs unterwegs, sind schwache Signal kaum vom Hintergrund zu unterscheiden. Bei der Kalibrierung sollte man aber die Ladekontrolle nicht vergessen. Nur wenn Proben- und Ladekontroll-Signal passen, kann man präzise und reproduzierbaren Daten erzielen.
Die Kontrolle
Das führt direkt zum dritten kritischen Faktor beim Western Blot: dem in der Ladekontrolle häufig verwendeten sogenannten Haushalts-Protein. Typische Haushalts-Proteine sind Aktin, Tubulin oder die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. Bei der Auswertung eines Western Blots wird die Menge des Zielproteins in Abhängigkeit von der Menge des Haushalts-Proteins bestimmt. Die Expression des Haushalt-Proteins darf also nicht von den experimentellen Bedingungen und der Manipulation der Zellen abhängen, etwa vom Entwicklungs- oder Hormonstatus der Zelle, der Behandlung mit bestimmten Substanzen oder des Gewebetyps.
Es ergibt also Sinn zu testen, wie stabil das ausgewählte Haushalts-Protein in den untersuchten Zellen tatsächlich exprimiert wird. Statt der Detektion von Haushalts-Proteinen kann man auch eine Gesamtproteinfärbung des Blots durchführen. Auch hier muss man einige kritische Punkte beachten. Hierzu gehören: ein zum Zielprotein passender linearer Nachweisbereich, stabile Signale mit geringer Variabilität zwischen verschiedenen Proben sowie die Kompatibilität der Probe mit der Immundetektions-Technik.
Die Antikörper
Auch bei Schritt vier, der Wahl von Antikörper und Nachweis-Chemie, kann einiges schiefgehen. Für quantitative Analysen empfehlen Harford et al. die Fluoreszenz-Detektion mithilfe von Fluorophor-markierten sekundären Antikörpern. Bei der Chemolumineszenz wird die Bindung des sekundären Antikörpers indirekt mit dem Reporterenzym Meerrettichperoxidase nachgewiesen. Die Enzymkinetik birgt hier eine zusätzliche Fehlerquelle für variable und nichtlineare Signale.
Bevor man den primären Antikörper einsetzt, sollte man ihn unbedingt überprüfen: Die Spezifität testet man mittels Knockout- oder Knockdown-Kontrollen sowie positiven und negativen Proteinproben. Die Selektivität kann man in Kontrollproben mit endogenen Expressionsleveln des Zielproteins kontrollieren. Zudem sollte man daran denken, dass auch die richtige Verdünnung und optimale Inkubationszeiten die Selektivität verbessern. Auf ein Recycling von Antikörpern sollte man besser verzichten.
Die Auswertung
Bleibt noch Punkt fünf übrig: Die Auswertung der Daten. Die Signale des Zielproteins müssen mit den Signalen der Ladekontrolle normalisiert werden. Dies ist Voraussetzung, um die relativen Mengen des Zielproteins über den Blot hinweg vergleichen und bestimmen zu können. Nur so kann man erkennen, ob Änderungen in der Bandenintensität tatsächlich biologische Unterschiede zwischen den Proben darstellen.
Außerdem müssen Hintergrundsignale, zum Beispiel unspezifische Banden, Verschmutzungen und Signale, die von der Membran ausgehen, von echten Signalen subtrahiert werden. Dazu stehen verschiedene Softwarepakete zur Verfügung. Diese ziehen die Hintergrundsignale mit speziellen Algorithmen ab, die zu den experimentellen Bedingungen passen, und quantifizieren die Zielbanden.
Was es sonst noch bei der Auswertung von Western Blots zu beachten gibt - und das ist eine ganze Menge – ist in dem Western-Blot-Ratgeber von Harford und seinen Kollegen ausführlich beschrieben.
Miriam Colindres
Pillai-Kastoori L. et al. (2020): A systematic approach to quantitative Western blot analysis. Analytical Biochemistry, 593: 113608
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