Die einschlägigen Hersteller von Detektions-Kits für RNA-Viren reagierten ziemlich flott, als es darum ging, die Kits auf den Nachweis von SARS-CoV-2 (SARS2) umzustellen. Die RNA dieser Viren wird üblicherweise mit einer RT-PCR detektiert. Die Kit-Produzenten mussten also lediglich die Primer für die RT-PCR tauschen und auf Zielsequenzen des SARS2-Genoms ausrichten. Noch Positiv- und Negativ-Kontrollen dazu und die Sache konnte losgehen.
Ganz so einfach war es in der Realität natürlich nicht, denn die Auswahl der Zielsequenz muss wohlüberlegt sein. Das knapp 30.000 Nukleotide große Genom von SARS2 beherbergt etwas mehr als ein Dutzend offene Leserahmen (ORF). Als Zielsequenzen eingesetzt, werden jedoch nur etwa eine Handvoll davon, wobei die Referenzlabore der einzelnen Länder teilweise unterschiedliche Ziele favorisieren (siehe Protokoll-Sammlung der WHO). In China sind dies zum Beispiel ORF1ab sowie N-Gen (Nukleoprotein). An der Charité in Berlin sind die Primer dagegen auf RdRP (RNA-dependent RNA Polymerase)- sowie E- und N-Gen gerichtet. Die Centers for Disease Control in den USA favorisieren hingegen Ziele im N-Gen, während das Institut Pasteur in Paris zwei Sequenzen in RdRP anvisiert.
Drostens Protokoll
Wichtig ist in jedem Fall, dass die SARS-CoV-2-Sequenzen spezifisch amplifiziert und zuverlässig von Sequenzen anderer Virenstämme unterschieden werden. Was man hierbei beachten muss, kann man im RT-PCR-Protokoll von Christian Drostens Gruppe an der Charité in Berlin nachlesen.
Um auf Nummer sicher zu gehen, rät Drosten zu einem dreistufigen Nachweisverfahren aus Real-Time-RT-PCRs. Im „First line assay“ wird eine Sequenz des E-Gens amplifiziert. Sind mindestens fünf Kopien vorhanden, sollte ein positives Ergebnis herauskommen. In diesem Fall qualifiziert sich die Probe für den „Confirmatory assay“, der auf eine RdRP-Sequenz abzielt. Entsteht auch hier ein PCR-Produkt, folgt schließlich der „Discriminatory assay“, bei dem eine SARS-CoV-2-spezifische Sequenz im RdRP-Gen amplifiziert wird.
Die häufig manuell durchgeführten RT-PCR-Tests kann man mit einem ziemlich simplen und eigentlich sehr alten Trick erheblich beschleunigen: Dazu poolt man die Abstriche mehrerer Testpersonen und analysiert zum Beispiel statt fünf individueller Tests eine Sammelprobe. Ist der Sammeltest negativ, spart man sich den Material- und Zeitaufwand für die Einzeltests. Ist er positiv, führt man zusätzliche Tests mit den zurückbehaltenen Proben durch.
Auf diesem Prinzip basiert zum Beispiel das Mini-Pooling-Verfahren, das eine Gruppe um Marcus Panning vom Institut für Virologie der Universität Freiburg in medRxiv vorstellte (DOI: 10.1101/2020.03.30.20043513). Ein ähnliches Vorgehen hatte bereits eine israelische Gruppe sowie ein gemischtes Team aus Forschern von der Stanford University sowie von Oracle und Google vorgeschlagen (medRxiv, DOI: 10.1101/2020.03.27.20043968). Sinnvoll ist das Pooling aber nur für Tests von Bevölkerungsgruppen, in denen der Durchseuchungsgrad noch sehr gering ist.
Diagnostik mit Gerät
Natürlich schlägt bei einer Pandemie, in der hunderttausende Virus-Tests durchgeführt werden müssen, auch die Stunde der großen Diagnostik-Gerätehersteller. Es dauerte zwar ein paar Wochen, bis sie aus den Startlöchern kamen. Danach folgte aber eine Pressemeldung nach der anderen, in der Roche, Cepheid, Qiagen, Abbott, Bosch und Co. vermeldeten, dass ihre Diagnose- oder Point-of-Care-Geräte für die SARS-CoV-2-Diagnostik bereit sind.
In den Mikrofluidik-Systemen dieser Instrumente wird aber auch nur mit Wasser gekocht, beziehungsweise mit Puffern und Polymerasen für die RT-PCR: Die meisten, wie zum Beispiel Roches Cobas 6800- und 8800-Systeme, Qiagens QIAstat-Dx Analyzer oder auch das als großer Durchbruch angekündigte Vivalytix-System von Bosch, basieren auf der etwas angestaubten RT-PCR – und die dauert nun mal ihre Zeit. Unter drei Stunden geht bei Roches Cobas-System nichts und auch das Vivalytix-Gerät von Bosch ist nicht wesentlich schneller.
Deutlich fixer sind dagegen isothermale Amplifikations-Verfahren, die bei gleichbleibender Temperatur ablaufen und ohne teure, schwere und komplizierte Thermocycler auskommen. Ein inzwischen schon klassisches Beispiel hierfür ist die RT-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP). Bei dieser finden reverse Transkription sowie DNA-Amplifikation bei einer konstanten Temperatur von meist 63°C in einem einzigen Reaktionsgefäß statt, das alle für die Reaktion nötigen Komponenten enthält: Reverse Transkriptase (RT), Strang-verdrängende DNA-Polymerase, dNTPs, Template-RNA sowie zwei innere und zwei äußere Primer.
Die LAMP-Reaktion erfolgt in drei Schritten: Im ersten wird das Startmaterial für die zyklische Amplifikation der Zielsequenz hergestellt, das aus einer doppelsträngigen DNA mit einer Haarnadelschlaufe an einem Ende besteht. An der Haarnadel bindet im zweiten Schritt der sequenzspezifische Vorwärts-Primer und startet die zyklische Amplifikation. An die hieraus resultierenden Produkte bindet schließlich der Backward-Primer und leitet ihre Verlängerung sowie das Recycling des Startmaterials ein. Am Ende entsteht eine Mischung unterschiedlich langer DNA-Sequenzen mit Haarnadelschlaufen.
Wilde Reaktionen mit LAMP
Der genaue LAMP-Ablauf ist aber nur etwas für hartgesottene Molekularbiologie-Freaks, die Spaß an völlig wilden Reaktionsabläufen und Schaubildern haben (Nucleic Acids Res, 28(12):e63). Für Praktiker ist viel entscheidender, dass man mit RT-LAMP beliebige Zielsequenzen sehr schnell und effektiv amplifizieren kann – und dass es für das Primerdesign freie Software-Tools gibt, zum Beispiel den PrimerExplorer.
Inzwischen entwickelten verschiedene Gruppen SARS-CoV-2-Tests auf Basis von RT-LAMP. Zu diesen gehört auch ein Team um Yi Wang vom Beijing Children’s Hospital (medRxiv, DOI:10.1101/2020.03.17.20037796). Die Chinesen wählten F1ab und N-Gen als Zielsequenzen und verwendeten Primer, die mit FITC und Biotin (F1Ab) oder Digoxigenin und Biotin (N-Gen) gelabelt waren. Die auf diese Weise markierten Amplifikate detektierte die Gruppe mit einem Nanopartikel-Biosensor im Point-of-Care-Teststreifenformat.
Der Streifen ist etwa so groß wie ein Objektträger und in einer Plastikhülle untergebracht, die auf der Vorderseite eine runde Öffnung hat, in die die Probe aufgetragen wird. In der Mitte der Hülle ist eine rechteckige Aussparung, auf der das Ergebnis des Tests zu sehen ist. Der Streifen selbst besteht aus vier Zonen: Probenzone, Konjugationszone, einem Stück Nitrozellulose sowie einer Absorptionszone.
Das RT-LAMP-Produkt wird in die Probenöffnung pipettiert, die sich direkt über der Probenzone befindet. Angetrieben von der Kapillarkraft (Lateral Flow) wandert sie in Richtung der Absorptionszone am anderen Ende des Teststreifens. Durchschreitet die Probe die Konjugationszone, rehydriert sie in dieser Nanopartikel (SA-DPNs), die mit einem Streptavidin-beladenen Farbstoff ummantelt sind. Die Biotin-Gruppen aus der Probe binden an das Streptavidin und wandern mit den SA-DPNs im Schlepptau weiter. Freie SA-DPNs werden ebenfalls abgelöst und folgen der Kapillarkraft.
Probe bleibt hängen
Im Nitrozellulose-Abschnitt führt der Weg über drei horizontale Testlinien mit einem Abstand von fünf Millimetern. Die erste enthält immobilisierte anti-FITC-Antikörper zum Aufspüren von F1ab-Amplifikaten, die zweite Anti-Digoxigenin-Antikörper zur Detektion von N-Gen-Amplifikaten und die dritte schließlich Biotin-BSA als Kontrolle. Enthält die Probe F1ab- und N-Gen-Antigene, bleiben die Nanopartikel an der jeweiligen Testlinie hängen, wodurch sich diese rot färbt. Für freie SA-DPNs endet die Reise an der Kontrolllinie, die durch ihre Rotfärbung bestätigt, dass die Wanderung der Nanopartikel funktioniert hat.
Bei SARS-CoV-2-positiven Proben färben sich die beiden Testlinien sowie die Kontrolllinie rot, ist die Probe negativ, wird nur die Kontrolllinie rot. Erscheint neben der Kontrolllinie nur eine der beiden Testlinien rot, ist der Test zweifelhaft und sollte wiederholt werden. Der Test dauert etwa eine Stunde, von der Probennahme bis zum Testergebnis und ist nach Angaben der Autoren sehr sensitiv und spezifisch.
Noch schneller ist der RT-LAMP-Test eines chinesisch-holländisch-österreichischen Teams um Cornelia Lass-Flörl von der Medizinischen Universität Innsbruck (medRxiv, DOI: 10.1101/2020.03.15.20036376). Das von der chinesischen FDA bereits zugelassene Verfahren hat schon einen Test mit 47 positiven und 213 negativen Patientenproben bestanden. Zielgene sind ORF1ab und N-Gen. Der Single-Tube-Ansatz enthält RT, DNA-Polymerase, sechs Primer, dNTPs sowie den Farbstoff SYTO-9 zur Fluoreszenzfärbung der amplifizierten Nukleinsäuren. Detektiert wird im ABI-7500-Gerät.
Die Gruppe testete die Spezifität des Nachweises mit einem breiten Spektrum an Viren und Bakterien und prüfte ihn auf falsch-negative Ergebnisse, indem sie die Proben gezielt mit potenziellen Inhibitoren versetzte, wie zum Beispiel Mucin, Tamiflu oder Adrenalin. Ursprünglich hatte das Team gehofft, dass ihr Assay quantitativ wäre, was sich jedoch bei Vergleichen mit RT-PCR-Tests nicht bestätigte.
Nachweis mit NEAR
Die isothermale Amplifikation ist inzwischen aber auch in kommerziellen Point-of-Care-Diagnostik-Geräten angekommen. So gab der amerikanische Pharma- und Diagnostik-Riese Abbott Ende März bekannt, dass auch seine ID-Now-Plattform für den SARS2-Test bereit ist. ID Now wurde ursprünglich von der Firma Alere entwickelt, die sich Abbott 2017 einverleibte. Im Gegensatz zu den RT-PCR basierten Geräten der Konkurrenz nutzt ID Now die isothermale Amplifikation von Zielsequenzen mit der sogenannten Nicking Enzyme Amplification Reaction (NEAR) für den SARS2-Nachweis.
Die von David Galas und seiner Gruppe 2003 am Keck Graduate Institute of Applied Life Science in Kalifornien entwickelte NEAR-Technik spielt sehr geschickt mit der Längen- und Temperatur-abhängigen Hybridisierung von DNA-Fragmenten an ein Template (PNAS, 100(8):4504-9). Das Nicking Enzyme zerschneidet zunächst einen Strang der Zielsequenz, wodurch ein längerer und ein kürzerer Einzelstrang entsteht. Bei der eingestellten Temperatur hybridisiert das längere Fragment gerade noch mit dem Template und dient als Primer für die Strang-verdrängende Polymerase. Das kürzere löst sich hingegen ab und bildet das Produkt der Reaktion. Da sich der Primer bei diesem Prozess immer wieder erneuert, stellt sich eine zyklische Reaktion ein, mit der das freigesetzte Oligo amplifiziert wird.
NEAR ist nicht nur superclever, sondern auch unglaublich schnell. Nach Angaben von Abbott steht ein positives Testergebnis in fünf Minuten, ein negatives in dreizehn Minuten fest. Das dürfte im Moment der Geschwindigkeitsrekord bei den SARS2-Tests sein. Mal sehen, wie lange er hält.
Die renommierte Nanobiotechnologin Jackie Ying vom NanoBioLab in Singapur arbeitet offensichtlich ebenfalls an einem isothermalen SARS2-Test-Kit, der zumindest ähnlich schnell sein dürfte. Genaueres wollte Ying, die einen Teil ihrer Postdoc-Zeit am Leibniz Institut für Neue Materialien in Saarbrücken verbrachte und auch Mitglied der Leopoldina ist, mit Verweis auf die „proprietary nature of this technology“ jedoch nicht verraten.
GeCRISPRt wird auch
CRISPR-Cas darf bei neuen Nachweisverfahren des SARS2-Virus natürlich nicht fehlen. Eine Gruppe um Charles Y. Chiu von der University of California, San Francisco, zu der auch Forscher von Abbott sowie der amerikanischen Biotech-Firma Mammoth Biosciences gehörten, wies die mit RT-LAMP amplifizierten Zielsequenzen mit einer modifizierten CRISPR-Cas-Technik nach, die sich SARS-CoV-2-DETECTR nennt (medRxiv; DOI: 10.1101/2020.03.06.20032334).
Startmaterial ist wie üblich extrahierte RNA aus dem Nasen- oder Rachenraum. Mit RT-LAMP werden zwei Regionen im N- beziehungsweise E-Gen amplifiziert, wobei nur so viele Kopien hergestellt werden, wie für die Detektion nötig sind. Um diese nachzuweisen, werden die LAMP-Produkte mit einer SARS2-spezfischen gRNA sowie der Nuklease Cas12a versetzt. Die gRNA bildet einen Komplex mit Cas12a und leitet die Nuklease zur Zielsequenz. Bindet der Komplex an die Zielsequenz, wird Cas12a aktiviert.
Im Gegensatz zu Cas9, die nur den gebundenen DNA-Strang schneidet, zerlegt die aktivierte Cas12a alles, was in ihre Nähe kommt. Dazu gehört auch eine modifizierte Einzelstrang-DNA (ssDNA), die als Reporter dient. Die ssDNA besteht aus einem am 5‘-Ende mit Fluorescein-Amidit (FAM) und am 3‘-Ende mit Biotin gelabeltem Oligonukleotid (FAM-TTATTATT-Biotin). Durch die Faltung des Oligos wird FAM durch Biotin daran gehindert zu fluoreszieren. Wird es jedoch von Cas12a zerschnitten, fällt das als Quencher agierende Biotin weg. FAM sendet hierauf ein Fluoreszenzsignal aus, das detektiert wird und eine positive Probe anzeigt.
Die Gruppe hat aber auch eine Detektions-Variante im Teststreifenformat entwickelt, bei der die Streifen in die Wells einer Mikroplatte eintauchen. Wie die weiter oben beschriebenen Nanopartikel-Teststreifen basieren auch diese auf simplen Kapillarkräften.
In der Eingangszone ist der Streifen mit anti-FITC-Antikörpern bestückt, die an Gold haften und FAM binden. Die Probe rehydriert die Goldpartikel und schleppt sie zunächst in eine Zone mit immobilisiertem Biotin-Ligand. Hier bleibt Biotin hängen, das von dem ursprünglichen FAM-TTATTATT-Biotin stammt oder durch Cas12a freigesetzt wurde. Freies FAM, das vom Schnitt einer positiven Probe herrührt, wandert weiter und stößt in der nächsten Zone auf immobilisierte anti-Kaninchen-Antikörper, die an anti-FITC-FAM-Gold-Komplexe in der Probenflüssigkeit binden. Da das Detektionsreagenz schon im Laufpuffer enthalten ist, erscheint das Ergebnis unmittelbar nach dem Lauf in Form eines violetten Strichs. Ist dieser in der oberen Zone, war die Probe positiv. Das Ganze dauert ungefähr dreißig Minuten.
SHERLOCK ermittelt
Ganz ähnlich funktioniert auch das SHERLOCK-Detektionssystem, das Feng Zhangs Gruppe am Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, USA entwickelte (zum Protokoll). Das Verfahren basiert jedoch auf amplifizierter RNA und nutzt statt Cas12a die RNAse Cas13 für die Detektion.
Zhangs Gruppe hat gerade auch noch ein schnelles RNA-Extraktionsverfahren getwittert, das ohne die derzeit zum Teil raren RNA-Extraktions-Kits auskommt. Sein Team nimmt für die RNA-Extraktion aus Nasen-Abstrichen einfach eine DNA-Extraktionslösung, die eins zu eins mit der Probe gemischt wird (zum Beispiel zwanzig Mikroliter Probe und 20 Mikroliter Extraktionslösung) und inkubiert die Mischung fünf Minuten bei 95 °C. Anschließend geht‘s direkt mit der qRT-PCR weiter. Zhangs detailliertes Protokoll finden Sie hier.
Ganz neu ist Zhangs Abkürzung für die RNA-Extraktion aber nicht. Auf die gleiche Idee kam auch schon die Gruppe der Molekularbiologin Xiaoxia Cui von der Washington University School of Medicine in St. Louis, USA (bioRxiv, DOI: 10.1101/2020.04.02.022384). Ihre Mitarbeiter verwenden ebenfalls einen DNA-Extraktionspuffer für die RNA-Extraktion aus Nasenabstrichen, erhitzen die Ansätze aber zunächst fünfzehn Minuten bei 65 °C und dann nochmal zwei Minuten bei 98 °C, um die in dem Puffer enthaltene Proteinase K zu inaktivieren.
Andrea Pitzschke
Foto: Pixabay/loochanin