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Chemisch definierter Lungen-Dummie

(28.10.2020) Mit Lungenorganoiden lässt sich die Immun­antwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion analy­sieren. Exakt definierte Kultur­medien sind dabei essentiell.
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SARS-CoV-2 infiziert in der Lunge insbesondere die Zellen des Alveolar­epithels, das die Lungen­bläschen auskleidet. Wer den Infektions­mecha­nismus und die Abwehr­reaktionen in diesen Zellen versteht, kann Therapie­ansätze entwickeln. Forscher verwenden deshalb häufig aus Alveolar­epithel-Zellen gezüchtete Lungen­organoide als Modell für die Infektion mit SARS-CoV-2. Bisher kommen sie dabei aber nicht ohne Feeder-Kulturen und Kälber­serum aus. Die co-kultivierten Fibro­blasten liefern die nötigen Wachstums­faktoren, erschweren aufgrund biologischer Schwankungen aber auch die Analyse und Inter­pretation der gewonnenen Daten. Das Gleiche gilt für undefinierte Medium-Zutaten wie Serum und Hirnanhangs­drüsen-Extrakt.

Das Alveolar­epithel besteht aus zwei Zelltypen: Den lang­gestreckten, für den Gas­austausch zuständigen AT1-Zellen sowie den kugel­förmigen AT2-Zellen. Letztere fungieren als multi­funktionale Stamm­zellen. Sie können sich selbst erneuern oder zu AT1-Zellen differen­zieren. Sie sekretieren aber auch sogenannte Surfactant-Proteine, welche die Oberflächen­spannung senken. Surfactant-Proteine halten die Alveolen in Form, dienen aber auch als Waffe gegen eindringende Viren und pathogene Mikro­organismen. Darüber hinaus sind AT2-Zellen reich bestückt mit dem Rezeptor ACE2, den nicht nur SARS-CoV-2 als Einfallstor nutzt, sondern auch verwandte Viren wie zum Beispiel SARS-CoV.

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Suche nach aussichtsreichen Paaren

Um bei der Kultivierung von Lungen­organoiden aus AT2-Zellen möglichst standar­disierte Bedingungen zu schaffen, stellte das Team des Zellbiologen Purusho­thama Rao Tata von der Duke University School of Medicine in Durham, USA, ein definiertes Medium zusammen. Dazu analysierten seine Mitarbeiter zunächst das Tran­skriptom von AT2-Zellen aus Mäusen, die sie in einem klassischen Medium kultivierten. In den Daten suchten sie nach Ligand-Rezeptor-Paaren, die in Fibroblasten beziehungs­weise AT2-Zellen differenziell exprimiert wurden.

Mit den identifizierten Molekülen peppten sie schließlich ein Basis­medium auf und testeten dieses bei der Fibro­blasten-freien Kultur von AT2-Organoiden. Heraus kam ein zunächst für Mäuse entwickeltes Serum- und Feeder-freies Medium (SFFF), das die Gruppe schließlich auch an die Kultur humaner AT2-Organoide anpasste. Um zu verhindern, dass sich die AT2-Zellen differen­zieren, fügten die Forscher einen Inhibitor der BMP-Signal­leitung hinzu und erhielten hierdurch ein AT2 Maintenance Medium (AMM). Mit einem weiteren Inhibitor-freien Medium (ADM), das zehn Prozent Human­serum enthält, konnten sie die Differen­zierung von AT2-Zellen zu AT1-Zellen gezielt induzieren.

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Nur runde Zellen

Für die Organoid-Kultur isolierte das Team AT2-Zellen aus gesundem humanen Lungen­gewebe und kultivierte diese in SFFF-Medium. Auch nach der Subkulti­vierung über zehn Passagen enthielten die Organoide ausschließlich runde AT2-Zellen. Die auf einer Matrigel-Matrix in SFFF-Medium kultivierten AT2-Zellen infizierten die US-Amerikaner schließlich mit einer SARS-CoV-2-GFP-Fusion. Anhand der Fluoreszenz verfolgten sie danach das Infektions­geschehen in den Lungen­organoiden.

Das Virus vermehrte sich in den infizierten Zellen rasant und trug nach zwei Tagen schon fast zu fünf Prozent des Transkriptoms bei. Im Vergleich zu nicht-behandelten Kontroll-Organoiden exprimierten die infizierten Zellen vermehrt Interferone, die als Liganden wiederum die Expression entspre­chender Rezeptoren aktivierten. Dafür waren Gene, welche die DNA-Replikation und den Zellzyklus fördern, reprimiert.

Immunhistochemische Analysen brachten noch mehr zum Vorschein. Demnach befiel das Virus etwa 30 Prozent der Zellen und drosselte in diesen die Produktion der Surfactant-Proteine. Besonders stark infizierte Zellen produzierten die wenigsten Surfactant-Proteine, wodurch sie teilweise ihre Form verloren. Die normaler­weise kugel­förmigen AT2-Zellen streckten sich und ähnelten eher AT1-Zellen, obwohl sich an ihrer Identität nichts geändert hatte. Ein bedrohliches Bild ergab sich aus Immun­färbungen des Apoptose-Markers Caspase 3. Demnach induziert das Virus den Zelltod nicht nur in infizierten Zellen, sondern auch in umliegenden nicht-infizierten Zellen.

Wie in echten Lungen

Transkriptom-Analysen von Organoiden und menschlichen Lungen­proben zeigten, dass die infizierten Lungen­organoide das Geschehen in Lungen von COVID-19-Patienten wider­spiegelten: Chemokin- und Cytokin-Produktion sowie Interferon-Liganden und -Rezeptoren werden durch die Infektion hoch­gefahren. Eine erhöhte Caspase-3-Aktivität kündigt den Zelltod an.

Die Lungenorganoide sprechen wie echte Lungen auf die Behandlung mit Wirkstoffen an. So induzierten zum Beispiel Interferone den Tod der AT2-Zellen. Eine Vorbehandlung der Lungen­organoide mit einer niedrigen Interferon-Dosis vor der SARS-CoV-2-Infektion hemmte dagegen die Vermehrung des Virus.

Andrea Pitzschke

Katsura H. et al. (2020): Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2 mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell, DOI: 10.1016/j.stem.2020.10.005

Bild: Pixabay/RoadLight



Letzte Änderungen: 28.10.2020

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