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Wachstumsstopp verrät Proteinfunktion

(09.06.2021) Exprimiert man Proteine in E. coli, wachsen die Zellen manchmal nicht weiter. Man kann diesen toxischen Effekt aber zur Funktionsanalyse nutzen.
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Rekombinante Proteine in E. coli zu exprimieren, gelingt mal mehr und mal weniger gut. Meist tastet man sich für jedes Protein aufs Neue an geeignete Bedingungen heran und wechselt beispielsweise den Fusions-Tag und dessen Position oder ändert die IPTG-Konzentration sowie die Induktions­dauer. Viele Proteine produziert E. coli danach fehlerfrei.

Es gibt aber immer noch genug, die defekt und funktions­unfähig aus der Expressions-Maschinerie heraus­kommen oder in Einschluss­körpern verpackt werden. Im schlimmsten Fall werden die Bakterien von der Expression der Proteine so stark gestresst, dass sie das Wachstum verlangsamen oder sogar ganz einstellen. Wo diese Toxizität einiger rekombinanter Proteine herrührt, ist im Einzelfall schwer zu bestimmen. Klar ist aber, dass die überexpri­mierten Proteine vitale Prozesse in E. coli massiv stören und zu sichtbaren Effekten führen, etwa einer verminderten Fitness.

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Nützliche Toxizität

Hemmt ein rekombinantes Protein das Wachstum von E. coli, besitzt es offen­sichtlich eine Aktivität, die bakterielle Prozesse beeinflusst – ein Enzym könnte zum Beispiel bakterielle Faktoren modifizieren, ein DNA-bindendes Protein die Transkription blockieren. Ferdinand Kappes’ Gruppe von der Xi’an Jiaotong-Liverpool University in Suzhou, China, sowie der RWTH Universität Aachen kam deshalb auf die Idee, die Toxizität rekombinanter Proteinen für einen Bakterien-Wachstum-Inhibitions-Screen (BGIS) auszunutzen, mit dem man die Funktion von Proteinen beziehungsweise Protein­domänen bestimmen kann.

Für den BGI-Screen kultiviert man E.-coli-Zellen, die ein Glutathion-S-Transferase (GST)-getaggtes Fusions­protein exprimieren, in einer üblichen Flüssigkultur. Als Kontrollen dienen Zellen, die GST exprimieren. Verglichen werden können beispielsweise Proteine, die von einer Zufalls­mutagenese stammen, verschiedene Deletions-Varianten oder bestimmte Protein­domänen. Ein Teil der heran­gezogenen Zellkulturen wird mit IPTG versetzt, der andere bleibt unbehandelt. Anschließend misst man den Einfluss der Induktion auf die Vitalität der Zellen. Hierzu streicht man Aliquots auf LB-Agar aus und zählt nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden die Kolonien. Alternativ überimpft man die Vorkultur in Flüssig-LB und bestimmt die Zelldichte (OD 600). Der Quotient aus der Zellzahl mit IPTG (IPTG+) sowie ohne IPTG (IPTG-) ist ein Indikator für die Proteinaktivität.

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Enzyme legen E. coli lahm

Die Forscher screenten verschiedene humane Proteine mit einer Größe von 10 bis 130 kDa mit dem BIGS-Verfahren. Exprimierten die E. coli-Zellen GST sowie Adapter- oder Transport­proteine, lag der Quotient aus IPTG+ und IPTG- nahe 1. Produzierten die Zellen hingegen Enzyme, etwa Kinasen und Transferasen sowie DNA- oder RNA-bindende Proteine, drosselten sie das Wachstum oder stellten es vollständig ein – der Quotient aus IPTG+ und IPTG- lag in diesen Fällen praktisch bei Null. Defekte Enzyme wie zum Beispiel Kinase-dead-Varianten wirkten sich dagegen nicht auf das Wachstum aus und bestätigten den vermuteten Zusammenhang zwischen Toxizität und biochemischen Eigenschaften.

Andrea Pitzschke

Guo H. et al. (2021): Bacterial Growth Inhibition Screen (BGIS): harnessing recombinant protein toxicity for rapid and unbiased interrogation of protein function. FEBS Letters, 595(10):1422-1437

Bild: AdobeStock/kongvector


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Letzte Änderungen: 09.06.2021

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