Zweidimensionalen (2D)-Zellkulturen fehlen neben der räumlichen Struktur auch viele andere Eigenschaften natürlicher, in Geweben gewachsenen Zellen. Näher dran an der Realität sind 3D-Zellkulturen, bei denen die Zellen in alle Richtungen wachsen können und über die extrazelluläre Matrix und die umliegenden Flüssigkeiten miteinander in Kontakt sind. Auch die Trefferquote in Medikamenten-Screenings hat sich durch den Umstieg von zweidimensionalen auf dreidimensionale Zellkulturen erhöht. Wirkstoff-Kandidaten, die in 3D-Modellen vielversprechende Ergebnisse zeigen, schaffen es eher durch Tierexperimente und klinische Studien als ihre Pendants aus zweidimensionalen Zellkulturen.
Trotz dieser Vorteile bleibt ein Problem der 3D-Zellkultur bestehen: Sie ist um einiges komplexer und variabler als die 2D-Zellkultur. Schon viele Forscher haben sich die Zähne daran ausgebissen, die 3D-Zellkultivierung effizienter zu gestalten, und mithilfe von vereinzelten Stamm- oder Tumorzellen einheitliche, rundliche Zellaggregate beziehungsweise Sphäroide zu erzeugen. Dazu kann man zum Beispiel Zellklümpchen in Mikrotiterplatten anziehen und einzelne, regelmäßig gewachsene Sphäroide aus diesen herauspicken und weiterkultivieren (siehe dazu „Rosinenpicker aus der Puszta“ auf LJ Online).
Hitzebeständige Borsten
Das ist aber ein mühsames Geschäft. Einfacher und auch erfolgversprechender ist eine Technik, die die Gruppe des Naturstoffchemikers Venkatesh Chelvam am Indian Institute of Technology Indore in Madhya Pradesh, Indien, entwickelte. Das wichtigste Instrument für die indische Methode zur Herstellung gleichförmiger Sphäroide ist – eine Haarbürste. Ihre Borsten sollten gleichlang und in regelmäßigen Abständen angeordnet sein und vor allem runde, kugelförmig verdickte Enden haben. Zudem sollte sie aus Holz oder Metall bestehen und hitzebeständige Borsten haben, damit man sie im Autoklaven sterilisieren kann.
Um mithilfe der Bürste ein Agarose-Gerüst beziehungsweise Scaffold zu fertigen, auf dem Sphäroide wachsen können, stellt man zunächst eine sterile Lösung aus 1,5 Prozent Agarose in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco (DPBS) her. Die Lösung gießt man in eine sterile Petrischale, bis sie etwa 2,5 Millimeter hoch in der Schale steht. Dazu kann man die Gießhöhe mit einem Strich an der Wand der Petrischale markieren oder das Gießvolumen ausrechnen – für eine 9-Zentimeter-Schale benötigt man 16 Milliliter. Anschließend schnappt man sich die sterilisierte Haarbürste und taucht ihre Borsten gerade so weit in die noch geschmolzene Agarose, bis die kugelförmigen Enden etwa zu drei Vierteln darin versinken, ohne den Boden der Schale zu berühren. Die Bürste belässt man in dieser Position, bis die Agarose nach etwa zwanzig Minuten fest geworden ist, und zieht sie danach vorsichtig aus dem Gel heraus.
Mit Rasierklinge ausschneiden
Anschließend schneidet man mit einer sterilen Rasierklinge einzelne Stücke aus dem Agarose-Gel, die etwa zwanzig „Bürsten-Mini-Wells“ enthalten, und transferiert diese in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Um sicherzugehen, dass man keine Kontamination einschleppt, legt man die 6-Well-Platte danach zwanzig Minuten unter ein UV-Licht.
Für die Besiedlung der Mini-Wells mit Zellen befüllt man sie mit je drei Millilitern Roswell-Park-Memorial-Institute (RPMI)-1640-Medium. Die Medium-Nährstoffe dringen in die Agarose ein und äquilibrieren sie. Wichtig ist, die Flüssigkeit unmittelbar vor dem Besiedeln möglichst vollständig zu entfernen – erst grob mit einer 1-Milliliter-Pipette, dann in Feinarbeit mit einer 10-Mikroliter-Pipette.
Die Inder kultivierten in den vorbereiteten Bürsten-Scaffolds Prostatakrebs-Zellen, die sie als 2D-Kultur in RPMI-1640-Medium herangezogen hatten. Nach dem Ablösen und Aufbereiten der Zellen pipettierten sie fünf Mikroliter einer Zellsuspension, die etwa 120.000 Zellen enthielt in jede Vertiefung der vorbereiteten Agarose-Matrix. Unter dem Mikroskop beobachtete sie, wie in jedem Mini-Well kleine Zellklümpchen auftauchten, die nach weiteren 12 bis 24 Stunden zu Sphäroiden heranwuchsen. Um diese am Leben zu halten und Nekrosen vorzubeugen, wechselte die Gruppe alle zwei Tage das Medium.
Andrea Pitzschke
Krishnan M. et al. (2021): Agarose Micro-Well Platform for Rapid Generation of Homogenous 3D Tumor Spheroids. Current Protocols, 1(7):e199
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