Die Genom-Editierung mit CRISPR/Cas9 gehört in vielen Labors zur Routine. Der Editier-Erfolg hängt jedoch ganz entscheidend vom Design der sgRNA ab, die Cas9 zur gewünschten Stelle im Genom schleust, an der die Nuklease einen Doppelstrangbruch erzeugen soll. Je effizienter die sgRNA Cas9 zur Zielstelle führt und je weniger sie sich auf dem Weg dorthin von ähnlichen Sequenzen (off-targets) ablenken lässt, umso besser.
Verschiedene Bioinformatik-Werkzeuge versprechen, die Entwicklungsarbeit zur perfekten sgRNA-Sequenz zu erleichtern (siehe dazu auch unseren Artikel „Software-Tools für das Genome Editing mit CRISPR“). Ihre Algorithmen berücksichtigen, welcher Organismus – oder vielmehr welches Genom – manipuliert werden soll und versuchen, sgRNA-Sequenzen die zu Off-target-Effekten neigen auszumustern. Aber ist die sgRNA, die ein solches Programm am Ende ausspuckt, tatsächlich praxistauglich und erkennt ihr Ziel punktgenau?
Fette Effizienz
Wie effizient sgRNAs in der Realität arbeiten, kann man mit entsprechenden Tests, etwa dem sogenannten Surveyor-Assay, herausfinden. Sein Prinzip ist recht einfach: Zellen werden mit Cas9 und der zu testenden sgRNA transfiziert, um Doppelstrangbrüche zu provozieren. Die zelleigene Reparatur (NHEJ) kittet die Brüche wieder, wobei Insertionen oder Deletionen auftreten. Mit einer PCR wird die genomische DNA rund um die Zielregion amplifiziert, die PCR-Produkte sind somit eine Mischung aus Fragmenten mit Wildtypsequenz, Insertionen oder Deletionen. Nach Denaturierung und Annealing paaren sich Stränge dieser Fragmente per Zufall und bilden doppelsträngige Fragmente mit oder ohne Mismatch. Eine Surveyor-Nuklease erkennt und schneidet ausschließlich die Mismatch-Fragmente. Auf dem Agarose-Gel sollten deshalb neben dem langen PCR-Produkt zwei kürzere Produkte erscheinen – und zwar als möglichst fette Banden.
Thorsten Müller und sein Team an der Universität Bochum waren vom Surveyor-Assay, angesichts nicht oder kaum detektierbarer Fragmente, aber nicht besonders begeistert. Die Bochumer heckten eine alternative Test-Methode für die sgRNA-Effizienz aus, die günstiger sowie weniger aufwendig ist und zudem bei Knock-in-Ansätzen Vorteile bietet.
Ein Plasmid, vier Konstrukte
Für den „homologous-independent targeted integration (HITI)-based sgRNA efficiency test“ (HIReff) der Gruppe benötigt man ein HIReff-Integrationsplasmid sowie vier kleine Konstrukte: eines für Cas9, eines für die zu testende sgRNA und je eines für sgRNA A und sgRNA B (siehe Bild). Die beiden Letzteren haben ihre zugehörigen Zielregionen auf dem Integrationsplasmid, das von Cas9 in zwei lineare Teile zerschnitten wird. Das Integrationsplasmid trägt drei Fluoreszenzmarker. Zur Bestimmung der Transfektionseffizienz dient ein blaufluoreszierendes Protein (BFP), dessen Expression von einem konstitutiven Promoter (CMV) angetrieben wird. Beidseitig des für BFP codierenden Gens sitzen die Zielstellen für sgRNA A und sgRNA B. Außerdem enthält das Plasmid ein Gen ohne Promoter, das für das rotfluoreszierende Protein mNectarin codiert, sowie downstream von diesem und gesteuert von einem konstitutiven Promoter ein EGFP- sowie ein Resistenzgen.
mNectarin-Fluoreszenzsignale entstehen in transfizierten Zellen nur, wenn die sgRNA einen Doppelstrangbruch bewirkt hat und der Marker positionsgenau in die anvisierte Stelle des Genoms eingebaut wird. Der Promoter des Zielgens muss für die mNectarin-Expression sorgen, was im Umkehrschluss bedeutet, dass mit mNectarin auch Promoteraktivitäten gemessen werden können. Das funktioniert aber nur, wenn mNectarin C-terminal und unter Beibehalt des Leserahmens an ein Zielgen fusioniert wurde. Tritt beim Einbau ein Leserahmenwechsel (Frameshift) auf, oder der Einbau war „falsch herum“, bleibt das Rotlicht aus. Die grüne Fluoreszenz des CMV-gesteuerten EGFP-Gens dient als Integrationskontrolle.
Erfolg in bunt
Zellen, die in allen drei Farben fluoreszieren wurden erfolgreich transfiziert, haben mNectarin C-terminal, in-frame an das Zielgen im Genom integriert und geben Auskunft über die Promoteraktivität (Signalstärkeverhältnis Rot-zu-Grün). Darüber hinaus lassen sie Rückschlüsse über die subzelluläre Lokalisation des exprimierten Zielgens zu. HIReff punktet deshalb besonders bei Knock-in-Experimenten, wie die Bochumer anhand des Alzheimer-Proteins Fe65 zeigen. In transfizierten HEK293T-Zellen erschienen Fe65-Fusionen in Form vieler roter Punkte, während EGFP-Signale die Zelle uniform färbten. Isoliert man Zellen mit erfolgreicher Integration per FACS, kann man zudem stabile Zelllinien generieren.
Was aber, wenn Zellen grün fluoreszieren und das mNectarin-Signal ausbleibt? Das kann mehrere Gründe haben, etwa einen Leserahmenwechsel, eine fehlende Fusion, oder der Einbau an einer anderen Stelle (off-target) des Genoms. Die Ursache, und damit auch die Frage, ob eine sgRNA genügend effizient ist, lässt sich noch immer mit einer PCR klären. In transfizierten Zellen wird die genomische DNA amplifiziert, wenn ein Primer auf dem zu inserierenden Fragment hybridisiert und der andere auf dem Genom nahe der Zielstelle. Ein PCR-Produkt kommt nur zustande, wenn die sgRNA ihren Job richtig gemacht hat. Endgültige Gewissheit verschafft eine Sequenzierung.
Andrea Pitzschke
Marks D. et al. (2021): Fast and reliable sgRNA efficiency testing using HIReff. BioRxiv, DOI: 10.1101/2021.09.15.460502
Bild: Marks et al.