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Akkurater Abkürzer
für Angler

(15.06.2022) Die DNA-Analyse von Pflanzen­material kann mühsam sein. Die „direkte PCR“ spart Zeit und Geld – noch schneller geht sie mit einer Angelsehne.
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Unter Pflanzenforschern scheiden sich die Geister, was wohl die geeignetste Methode zur DNA-Analyse über PCR sei. Die einen schwören auf Klassiker wie die CTAB-Methode, welche Cetyl­trimethyl­ammoniumbromid, eine Chloroform-Extraktion und Fällung mit Ethanol erfordert. Die anderen setzten auf kommerzielle DNA-Aufreini­gungs­kits mit Säulchen und diversen Tinkturen.

Und dann gibt es noch eine dritte Partei, die auf Kosten und Zeit schaut und überzeugt ist, die DNA-Isolierung könne man sich ohnehin sparen. Ein Schnipselchen Gewebe im Reaktionsmix enhält schließlich genügend Zellen und somit auch DNA, um unmittelbar als Template zu dienen. Dieser Abkürzer der „direkten PCR“ spart Plastikmüll und Kreuzkonta­minationsgefahr, welche in jedem Lösungstransfer-Schritt bei Aufreinigungs­verfahren lauert. Er ist aber heikel. Schließlich kann ein Futzelchen zu viel Gewebe die Reaktion vereiteln, weil darin eben nicht nur DNA, sondern ein ganzes Sammelsurium potenzieller Inhibitoren steckt. „Weniger ist mehr“ lautet die Devise, denn solange die PCR spezifisch amplifiziert, macht man lieber ein paar Zyklen mehr und setzt weniger (Inhibitoren-trächtiges) Pflanzen­material ein. Gerade bei hohen Probenzahlen wie etwa beim Genotyping sind verlässliche Abkürzer­strategien gefragt.

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Pipettenspitzen und Eis-am-Stiel

Luca Comai und sein Team von der University of California in Davis haben für die direkte PCR Optimierungs­bedarf gesehen und sich überlegt, wie man möglichst einfach an Zellinhalte herankommt, Inhibitoren jedoch nicht die kritische Masse erreichen. Ihre Methoden­entwicklung wird sukzessive minimalistischer. Am Anfang standen geschnittene (20µl-)Pipettenspitzen, die in ein Blatt gedrückt und dann unmittelbar in den PCR-Ansatz durch zehnmaliges auf und ab Pipettieren gespült werden.

Dann kam eine Methoden­variante, bei der die Pipettenspitze einfach gleich im Reaktions­ansatz verblieb, oder vielmehr ein Teil der Spitze. Eine Spitze reicht für ein Dutzend Proben, weil sie scheibchenweise aufgebraucht wird: die Spitze pikst in Blatt 1 und wird über Reaktions­ansatz 1 mit einer Schere gekürzt. Die gekürzte Spitze pikst in Blatt 2 … und so weiter. Als rückseitiger Widerstand dient ein Holzstab eines Eis-am-Stiel, entlang dessen man sich – mit genügend Abstand der einzelnen Pikspunkte – vorarbeiten kann.

Zweimaliges Waschen und Abwischen der Schere birgt allerdings die Gefahr von Kreuzkonta­minationen. Noch einfacher geht es mit einer Angelsehne. Auch diese verbleibt direkt im PCR-Ansatz (10µl). Von diversen Fabrikaten haben sich alle als PCR-kompatibel erwiesen. Zur Vorbereitung kann man eine 0,28 mm dicke Angelsehne in ca. 4 mm kurze Stücke schneiden. Mit einer Pinzette schnappt man sich ein solches Stück, pikst es in ein Blatt und lässt es in den PCR-Ansatz fallen. Vorsicht, auch hier lauert Kontamina­tionsgefahr (Pinzette besser jedes Mal abwischen).

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Gleiche Aussagekraft

Alternativ, und mit ein weniger Erfahrung, kann man auf eine noch feinere (die dünnste überhaupt verfügbare) Angelsehne umsteigen: 0,08 mm. Da sie durchsichtig und selbst mit der feinsten Pinzette schwer zu greifen ist, lässt man sie einfach erst einmal auf der Spule. Die Pinzette greift kurz über dem Schnurende an, welches nun ins Blatt pikst und abgeschnitten wird, um in den zugehörigen PCR-Ansatz zu fallen. Selbst ein zarter Keimling wird einen so hauchfeinen Piks schadlos überleben. Unterm Mikroskop zeigt sich, dass tatsächlich Pflanzen­material anhaftet.

Die Forscher haben die Pipettenspitz-Methode hinsichtlich Spezifität und Sensitivität an diversen Genabschnitten (ca. 400 bp) von Arabidopsis- und Reisblättern getestet; die Angelsehnen-Methode mit Arabidopsis, Kartoffel und Dotterlein, und dabei auch auf etwaige Kreuzkonta­mination geachtet. Die trat nicht auf. Mit 33 bis 40 Zyklen hat so eine direkte PCR die gleiche Aussagekraft wie eine, die über den mühsamen CTAB-Weg geht. Wer größere Genotypisie­rungsprojekte plant, sollte seine Angelsehnen­stücke besser in PCR-Gefäße mit Wasser deponieren und erst am Ende zu allen Proben den PCR-Mastermix hinzugeben. In Wasser sind die Templates langlebiger (>24 Stunden).

Andrea Pitzschke

Lynagh P. et al. (2022): Accurate Direct PCR with Arabidopsis and rice. BioRxiv, DOI: 10.1101/2021.07.16.452406

Bild: Pixabay/GA_Melon





Letzte Änderungen: 15.06.2022