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Varianten-Überwachung
im Abwasser

(13.07.2022) Mit dem Tool Freyja können gefährliche neue SARS-CoV-2-Varianten frühzeitig und automatisiert in Abwasser nachgewiesen werden.
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Zwischen den sich wiederholenden Corona-Wellen fällt es zunehmend schwerer Luft zu holen – die Wellen scheinen ineinander überzugehen und eine bisher dominierende Variante wird von einer neuen abgelöst. Umso wichtiger ist es, potenziell gefährliche Varianten (Variants of Concern, VOCs) möglichst früh zu erkennen.

Was tatsächlich in einer Menschen­population kursiert, können Abstriche in Kliniken, die je nach Testkapazitäten nur bestimmte Personen testen, kaum erfassen. Selektive Sequenzierungen genügen nicht. Dagegen sind Abwasser­proben wesentlich repräsentativer. Die Zusammensetzung der Varianten in derart komplexen Proben aufzudröseln, ist aber eine ziemlich harte Nuss. Bislang konnten Forscher nur gezielt nach einer oder wenigen Varianten Ausschau halten – mittels RT-qPCR und zu den jeweiligen Mutationen passenden Primern.

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Barcode-Bibliothek

Eine Hundertschaft von Forschern aus verschiedenen Abteilungen der University of California in San Diego und dem Scripps Research Institute hat eine Strategie entwickelt, die in Abwasser­proben nicht nur bekannte SARS-CoV-2-Varianten und deren Mengen­verhältnis erfasst – die Technik erkennt mithilfe des Tools „Freyja“ auch sich anbahnende neue genetische Linien. Das Verfahren ermöglicht es, die Häufigkeit von Mutationen (SNVs) sowie die Sequen­ziertiefe an jeder Stelle entlang des Genoms zu ermitteln. Aus den Sequenzier-Datensätzen erkennt Freyja das relative Vorkommen bekannter sowie bisher unbekannter SARS-CoV-2-Linien (für mehr Details siehe Freyja auf GitHub).

Die wichtigste Komponente der kalifornischen Überwachungs­methode ist eine systematisch zusammen­gestellte Bibliothek von Barcodes, die Amplifikation und Sequenzierung durchlaufen. Die Sequenz der Barcodes leitet sich von charakteristischen Mutationen bekannter Varianten(linien) ab, und zwar systematisch anhand einer komplizierten Codierungs­matrix. Die Barcodes berücksichtigen über 1.000 bekannte Varianten und deren Abstammungs­verhältnisse. Zum Glück sind diese gut dokumentiert und öffentlich verfügbar (UShER: Ultrafast Sample placement on Existing tRee).

Herunterskaliert und automatisiert

Es werden nur kurze Abschnitte sequenziert, die dank Primerdesign und Barcodierung genügend Informationen enthalten. Die Probenauf­bereitung selbst ist im Miniatur­maßstab gehalten: cDNA-Synthese sowie Aufreinigung sind auf ein Zwölftel beziehungsweise ein Sechstel gegenüber dem Hersteller­protokoll herunterskaliert.

Die Forscher konzentrierten zunächst die RNA aus zehn Millilitern Abwasser mit magnetischen Partikeln (affinity capture) und suchten darin per RT-qPCR die drei typischen SARS-CoV-2-Gene N1, N2 sowie E. Von den SARS-CoV-2-positiven Proben erstellten sie eine NGS-Bibliothek, die sie mit entsprechenden Oligos indexierten. Nach cDNA-Synthese und Aufreinigung ermittelte die Gruppe anhand einer groben Sequenzierung zunächst, wie viel des Probenvolumens jeweils zum Erreichen einer einheitlichen Leseintensität (read depths) nötig war. Anschließend verdünnte sie die Proben, poolte sie und sequenzierte sie schließlich. Die meisten Handgriffe des Protokolls übernahmen Roboter und auch die Analyse der Sequenzdaten lief weitgehend automatisch mithilfe des Alignment-Tools Minimap2 sowie dem für Virusamplicons entwickelten Werkzeug iVar zum Bereinigen von Primersequenzen.

Zehn Tage Vorsprung

Von 131 Abwasserzuläufen aus 360 Gebäuden am Uni-Campus der UCSD hatten die kalifornischen Forscher von September 2021 bis Februar 2022 täglich Proben entnommen. In diesen war alles enthalten, was zigtausende Studenten und Campus-Angehörige ausschieden, unter anderem auch die SARS-CoV-2-Varianten Epsilon, Alpha sowie Delta – und ab Ende November auch die ersten Omikron-Varianten (B.1.1.529 und dessen Abkömmlinge), die erst zehn Tage später in den Kliniken San Diegos auftauchten. Nach nur einem Monat repräsentierte Omikron bereits 95 Prozent aller erfassten SARS-CoV-2-Sequenzen. Die Delta-Variante hingegen blieb – absolut gesehen – konstant, geriet jedoch durch die Omikron-Varianten in den Hintergrund.

Die Gruppe sieht den größten Vorteil der Abwasser­überwachung darin, mit relativ wenigen Proben einen sehr großen Teil des Infektions­geschehens in der Bevölkerung überwachen zu können. Zudem kann sie VOCs frühzeitig aufspüren und ihre Entwicklung verfolgen.

Andrea Pitzschke

Karthikeyan S. et al. (2022): Wastewater sequencing reveals early cryptic SARS-CoV-2 variant transmission. Nature, DOI: 10.1038/s41586-022-05049-6

Bild: Pixabay/chriskeller




Letzte Änderungen: 13.07.2022