Mit entsprechenden Bauplänen ausgestattet, produzieren Bakterien bereitwillig rekombinante Proteine oder andere Verbindungen. Sind diese jedoch zu groß für die Exkretionssysteme des Bakteriums, sammeln sie sich im Innern an und blockieren schließlich die physiologischen Abläufe in der Zelle. Dies behindert insbesondere die reibungslose Produktion von Carotinoiden, etwa beta-Carotin in entsprechenden „Zellfabriken“.
Um auch diese zügig aus der „Produktionshalle“ herauszubekommen und Platz für neusynthetisierte Carotinoide zu schaffen, entwickelte ein chinesisches Forscherteam ein künstliches Transportsystem für große, hydrophobe Moleküle (Artificial Membrane Vesicle Trafficking System, AMVTS). Werden E.coli oder andere Gram-negative Bakterien mit AMVTS ausgestattet, können sie auch klobige und fettliebende Verbindungen, ganz unabhängig von klassischen Protein-basierten Transportwegen, exkretieren.
AMVTS basiert auf modifizierten sogenannten äußeren Membranvesikeln (OMV), wobei die zelleigenen Membranlipide sowohl für die Verpackung als auch den Transport genutzt werden. Die in der Zelle hergestellten lipophilen Substanzen landen zunächst in der inneren Zellmembran, die bei Gram-negativen Bakterien über das Periplasma und Brückenproteine mit der Außenmembran verbunden ist. Die kontinuierlich zur Außenmembran abwandernden Fette werden in Form von knospenden, sich ablösenden Vesikeln endgültig ins Umgebungsmedium entlassen.
Würde man also den natürlichen Knospungsprozess forcieren, hätte das zwei Konsequenzen: Einerseits gelangten mehr Vesikel, die mit den gewünschten Produkten beladen sind, nach außen. Andererseits würde die Zellfabrik schrumpfen, da sie mit jedem abgeschiedenen Vesikel ein Stück ihrer Membran beziehungsweise Außenwand verliert. Damit es in der Zelle für den reibungslosen Betrieb dennoch nicht zu eng wird, muss neue Bausubstanz eingelagert werden. Sprich, für jedes sich ablösende Membran-Molekül (Lipid) wird an anderer Stelle ein neues eingebaut.
Um die Abkapselung der OMVs zu verstärken, knockte die Gruppe systematisch Gene aus, die bei der Vesikelbildung eine Rolle spielen oder überexprimierte sie. Wie sich dies auf die Exkretion auswirkte, testeten die Chinesen in einem E. coli-Stamm, der beta-Carotin exprimierte. Knockten sie die Gene tolA, tolR und nlpI einzeln aus, transportierten die Zellen bis zu 0,6 Milligramm beta-Carotin pro Gramm Zelltrockengewicht und damit viermal mehr als der Wildtyp-Stamm aus der Zelle heraus. Noch wesentlich mehr beta-Carotin, nämlich zwei Milligramm pro Gramm Trockengewicht, schleusten tolA/nlpI-Doppelmutanten aus den Zellen.
Beim Ersatz der verlorenen Zellwand-Substanz kam den Forschern zugute, dass E. coli ein ziemlich einfallsloser Baumeister ist und zu etwa 70 bis 80 Prozent Phosphatidylethanolamin (PE) verwendet. Die PE-Biosynthese verläuft über einen vierstufigen Weg. Die Gene der beteiligten Enzyme überzuexprimieren, lag somit auf der Hand. Um ein allgemeingültiges Muster zu erkennen, führte das Team die Überexpression aber nicht nur in der tolA/nlpI-Doppelmutante, sondern auch in anderen Mutanten ihrer Kandidatenserie durch.
Für drei der vier PE-Synthese-Module zeichnete sich eine Produktionssteigerung ab, wobei eine Kombination den größten Effekt zeigte. Als beste Zellfabrik bezüglich Gesamtgehalt und sekretiertem beta-Carotin erwies sich schließlich ein Stamm, der Enzyme für den ersten und dritten PE-Synthese-Schritt überexprimiert und zugleich den tolA/nlpI-Gendefekt trägt. Hier sind Vesikel-Abkapselung und Wiederauffüllung der verlorenen Wandlipide optimal abgestimmt: Es wird so viel nachgeliefert, wie nach außen abgeht.
Unter dem Elektronenmikroskop sind die modifizierten Zellen genauso groß wie die Wildtyp-Zellen, an ihrer Oberfläche sind jedoch verstärkt OMVs zu sehen, die sich gerade ablösen. Etwa die Hälfte des beta-Carotins landet im Kulturüberstand, aus dem es sich über Ultrazentrifugation aus den tieforangen OMVs gewinnen lässt.
Das künstliche Vesikelsystem ist aber nicht nur für den Transport von beta-Carotin in E. coli geeignet. Geschickt adaptiert könnte man mit der AMVTS-Strategie auch andere Zellen dazu bringen, gewünschte hydrophobe Moleküle effektiv zu sekretieren.
Andrea Pitzschke
Wu T. et al. (2019): Engineering an Artificial Membrane Vesicle Trafficking System (AMVTS) for the excretion of β-carotene in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology, DOI: doi: 10.1021/acssynbio.8b00472
