Versteckte Insertionen
(11.03.2020) Unerwünschte Mehrfach-Integrationen sind ein Problem beim Genom-Editing mit CRISPR/Cas9. Mit der konventionellen PCR-Analyse übersieht man sie häufig.
Theoretisch sollte das Genom-Editing mit CRISPR-Cas9 so verlaufen, dass die von der guideRNA (gRNA) geleitete Cas9-Nuklease punktgenau im Genom schneidet und die sequenzspezifischen Doppelstrangbrüche durch die zelleigenen Reparaturmechanismen NHEJ (Neighbourhood End Joining) oder HDR (Homology-dependent Repair) wieder geschlossen werden. Während NHEJ primär für Leserahmenverschiebungen und somit Knockouts sorgt, kann mithilfe der HDR eine zusätzliche Wunschsequenz im Genom untergebracht werden. Diese muss hierzu mit kurzen Sequenzabschnitten an beiden Enden versehen sein, die homolog zu den entsprechenden Sequenzen an der Schnittstelle sind.
Ein internationales Team um Timofey S. Rozhdestvensky von der Universität Münster generierte mit CRISPR-Cas9 und HDR sogenannte gefloxte Mäuse. Das Genom dieser Mäuse wird hierzu mit zwei LoxP-Abschnitten versehen, die letztlich dazu dienen, ein dazwischenliegendes Gen per Rekombinase auf Kommando herauszuwerfen. Um alles in einem Aufwasch erledigen zu können, schleuste die Gruppe eine Donor-DNA in die Zellen ein, die beide LoxP-Abschnitte enthielt – jeweils flankiert von den entsprechenden homologen Armen.
Nur eine von 20
Nach der Injektion der befruchteten Eizellen war unter den herangezogenen F0-Mäusen aber nur eine von zwanzig positiv. Das machte die Forscher stutzig. Den Einbau der Donor-DNA hatten sie zunächst mit einer PCR analysiert, deren Primer auf beiden Seiten der integrierten DNA außerhalb der homologen Arme banden. Rozhdestvenskys Mitarbeiter erwarteten also in jedem Fall ein PCR-Produkt: Ohne Insertion ein kürzeres (Wildtyp oder Indels), bei erfolgreicher Insertion der Donor-DNA ein entsprechend längeres. Sie fanden mit der PCR aber nur bei einer Maus eine korrekt integrierte DNA.
Um der Sache auf den Grund zu gehen, modifizierten die Forscher die PCR und analysierten die zwanzig Mäuse erneut. Bei dieser PCR zielte ein Primer auf eine Sequenz des Genoms abseits der Insertionsstelle, der andere auf eine Sequenz innerhalb der Donor-DNA, die nur bei erfolgreicher Integration im Genom vorhanden sein konnte. Und plötzlich detektierte die PCR nicht nur bei einer Maus die Integration von mindestens einem Insert, sondern bei sechs Mäusen.
Ereignisse übersehen
Die erste PCR-Strategie, die offensichtlich Integrations-Ereignisse übersieht, entspricht dem gängigen Verfahren, mit dem der Einbau der Donor-DNA bei CRISPR-Cas9 analysiert wird. Offenbar fanden in den positiv getesteten Tieren aber mehrere Insertionen auf einmal statt, und zwar in Head-to-Tail-Manier. Dass bei der ersten PCR nur eine Maus positiv war, lag schlicht an den langen Head-to-Tail-Insertionen, die von der Polymerase kaum noch zu amplifizieren waren.
Da F0-Mäuse gewöhnlich genomische Mosaike aus einer Mischung von Zellen mit Wildtyp-Genom, Mehrfach-Integration und korrekter Integration sind, kann man in der F1-Generation durchaus die gewünschten Tiere finden. Das beruhigt. Den Herstellungsprozess muss man also nicht ändern – nur die Produkte genauer überprüfen.
Die Forscher um Rozhdestvensky schlagen auch gleich eine Strategie vor, mit der man die korrekte Integration der DNA von nicht gewünschten Mehrfach-Integrationen unterscheiden kann. Hierzu führt man zunächst PCRs durch, bei denen je ein Primer auf dem Genom außerhalb der vermeintlichen Integrationsstelle und einer auf der Donor-DNA liegt. Dies gilt für beide Seiten. Das heißt der Forward-Primer, der in der 5'-Region der Integrationsstelle bindet, wird mit einem Donor-DNA-spezifischen reversen Primer kombiniert, der in der 3'-Nachbarschaft des linken Homologie-Arms bindet und umgekehrt.
Erst positiv, dann negativ
Danach weiß man, welche Kandidaten die gewünschte DNA integriert haben. Um aus dieser Vorauswahl Einzel- von Mehrfach-Integrationen zu unterscheiden, folgt eine weitere PCR mit bidirektionalen, Donor-DNA-spezifischen Primern. Der Forward-Primer liegt hier am 3‘-Ende, der Reverse-Primer am 5‘-Ende. Ein Produkt kommt nur zustande, wenn eine Head-to-Tail-Situation vorliegt. Wunsch-Exemplare müssen also in der ersten PCR-Analyse ein positives, in der zweiten ein negatives Ergebnis liefern.
Für zusätzliche Sicherheit empfiehlt sich ein Southern-Blot. Die Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme platziert man idealerweise auf beiden Seiten der LoxP-Motive (oder einem sonstigen Fremd-DNA-Objekt). Im Fall von Mehrfach-Integrationen ergeben Sonden für Donor-DNA, aufgrund der mehrfachen Schnittstellen beziehungsweise Fragmente, ein komplexeres Muster.
Wer glaubt, die Head-to-Tail-Insertion sei Panikmache und beträfe ohnehin nur gefloxte Mäuse, irrt. Das Team um Rozhdestvensky führte systematisch CRISPR/Cas-Experimente mit verschieden langen Donor-DNAs durch, die auf unterschiedliche Einbaustellen zielten. Immer traten auch multiple Integrationen auf.
Andrea Pitzschke
Skyrabin B. et al. (2020): Pervasive head-to-tail insertions of DNA templates mask desired CRISPR-Cas9–mediated genome editing events. Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.aax2941
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