Vier ist besser als eins

Antikörper gegen das SARS-2-Virus zielen meist auf das Oberflächen­protein Spike (S) des Virus. Dieses besteht aus der Unter­einheit S1, die auch die Rezeptor­binde­domäne (RBD) beherbergt, sowie der für die Fusion mit den Wirtszellen verant­wortlichen Untereinheit S2. Auch der zur Bekämpfung des Vorgänger-Virus SARS-1 eingesetzte monoklonale humane-Antikörper CR3022 zielte auf ein Epitop in der RBD. Trotz einer relativ hohen Sequenz­homologie zwischen den Spike-Proteinen der beiden Viren richtet er beim SARS-2-Virus jedoch wenig aus.

Eine Gruppe um Ohad Mazor und Ronit Rosenfeld vom Israel Institute for Biological Research in Ness-Ziona suchte deshalb in Lymphozyten von COVID-19-Rekon­valeszenten sowie schwer an COVID-19 erkrankten Patienten nach wirksameren Antikörpern. Das Serum von zwei Patienten war nach den Ergebnissen von RBD-Binde- und Neutrali­sationstests vielversprechend. Aus dem Blut gewannen die Forscher mittels Dichte­gradienten-Zentrifu­gation mononukleäre Zellen für die RNA-Extraktion.

Domänen verbunden

Die umgeschriebene cDNA diente dann als PCR-Template zur Amplifikation von Fragmenten, die für die variable Region in Antikörpern codieren. Leichte und schwere variable Domänen (VL, VH) amplifizierte die Gruppe ebenfalls mit entsprechenden Primern. Damit hatte sie alle Bausteine beisammen, um mithilfe der Overlap-Extension-PCR sogenannte Single Chain Variable Fragment (scFv)-Antikörper­fragmente herzustellen, bei denen die Antigen-erkennenden, variablen Domänen der leichten und der schweren Kette eines klassischen Antikörpers kovalent verbunden sind.

Jetzt mussten die Israelis das scFv-Repertoire noch in einen Phagemid-Vektor klonieren, um Phagen zu gewinnen, welche die Antikörper an ihrer Oberfläche präsentieren und gleichzeitig deren Bau­anleitung bereithalten. Ob sich unter den erhaltenen knapp zehn Millionen Klonen ein brauchbarer versteckte, überprüfte die Gruppe mit einem Phagen­display. Mit Strepatividin-bemantelten Magnet­kügelchen, an denen sowohl die RBD als auch die gesamte S1-Untereinheit über einen Biotin-Tag immobilisiert war, reicherte sie mit dem Phagen­display sukzessive stark bindende Klone an.

In Hamsterzellen exprimiert

Die Forscher isolierten danach die Phagemid-Vektoren dieser Klone und exprimierten die scFv-Fragmente in CHO-Zellen. Bei der Umklo­nierung statteten sie die scFv-Fragmente mit den konstanten CH2-CH3-Fc-Fragmenten eines humanen IgG1 aus. Die hieraus erhaltenen scFv-Fc-Antikörper exprimierten sie schließlich in CHO-Zellen und isolierten sie mithilfe von Protein-A-Säulen.

Auf diese Weise erhielt das israelische Team acht Antikörper, die spezifisch an die S1-Untereinheit sowie die RBD banden. Nach einem ELISA mit S1 und RBD als Antigen wählten sie sechs Antikörper aus, die besonders niedrige Disso­ziations­konstanten aufwiesen.

Diese Antikörper charakterisierte die Gruppe mit der sogenannten Biolayer-Inter­ferometrie (BLI) genauer. Mit dieser kann man die Wechsel­wirkungen zwischen einem immo­bilisierten Protein und einem Analyten, etwa einem Antikörper, analysieren und zum Beispiel Disso­ziations­konstanten oder Affinitäts­parameter bestimmen. Die Analysen ergaben, dass die Antikörper an unterschiedliche RBD-Epitope binden und sich entsprechend in vier Gruppen einteilen lassen.

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Virus neutralisiert

Wie gut die Antikörper das SARS-2-Virus neutralisieren, testeten die Forscher mithilfe von Vero-E6-Zellen, die sie mit dem Virus infizierten. Dazu inkubierten sie eine definierte Menge Viren mit den einzelnen Antikörpern und brachten eine dünne Schicht auf der Zellkultur aus. Nach zwei Tagen zählte die Gruppe schließlich die entstandenen Plaques. Beim schlagkräftigsten Antikörper (MD65) lag die Neutrali­sationsdosis (NT₅₀), welche die Hälfte der Plaques verhindert, bei 0,9 µg/ml. Ähnlich effektiv blockierten auch die Antikörper MD45 und MD67 (NT₅₀ 4µg/ml) sowie MD62 (NT₅₀ 7,5 µg/ml) die Vermehrung von SARS-2.

Die Israelis schlagen deshalb vor, diese an verschiedene Epitope bindenden Antikörper als „Team“ gegen das SARS-2-Virus einzusetzen. Dies würde auch die Wahrschein­lichkeit verringern, dass das SARS-2-Virus durch Mutation dem Zugriff eines Antikörpers entkommt.

Andrea Pitzschke

Bild: Pixabay/succo (bearbeitet)

Noy-Porat T. et al. (2020): Tiger team: a panel of human neutralizing mAbs targeting SARS-CoV-2 spike at multiple epitopes. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.05.20.106609