Wann immer bei PCRs hohe Effizienz und Spezifität ausschlaggebend für den Erfolg sind, greift man gern zu hochleistungsfähigen Spezial-Polymerasen und auch um einiges tiefer in die Tasche. Wirtschaftlicher und einfacher könnte es aber sein, die Alltags-Taq zu höherer Leistung zu motivieren.
Das geht gewöhnlich mit sogenannten „Enhancern“, welche entweder als Geheimrezeptur aus kommerzieller Quelle oder vom Griff ins Chemikalienregal her stammen. Hier gibt es eine Vielzahl an Substanzen, deren positive Effekte beispielsweise darauf beruhen, die Schmelztemperatur von DNA zu senken (DMSO), das Durchhaltevermögen der Polymerase zu fördern (Trehalose) oder DNA und Polymerasen zu stabilisieren (Detergenzien, BSA).
Gut versteckt?
„Irgendwie seltsam“, fanden Forscher der Russischen Akademie der Wissenschaften, dass Trehalose, aber keinem einzigen anderen Kohlenhydrat eine „Enhancer“-Wirkung zugeschrieben wird. Vielleicht verbirgt sich ja unter den Mono- und Disacchariden noch ein viel potenterer Akteur?
Systematisch nahmen sie die Frage in Angriff. Zunächst ließen sie verschiedene Polymerasen (AmpliTaq, Phire, Phusion HF, Taq) im Vergleich antreten – alle ohne „Enhancer“. Hier zeigten sich die zu erwartenden Unterschiede an Produktmengen (Endpunktanalyse: ein 525 bp Produkt).
Die normale Taq brachte nur einen geringen Ertrag, der sich nochmals reduzierte, wenn EvaGreen im Reaktionsmix enthalten war. In Gegenwart von SYBR Green schlug die Normalo-Taq gänzlich fehl. Offenbar kam sie mit interkalierenden Farbstoffen nicht klar. Um diese Schwachstelle zu beheben, testeten die Russen neben DMSO (als „Enhancer“-Kontrolle quasi) verschiedene Mono- und Disaccharide (Trehalose, Sukrose, Laktose, Glukose, Mannose, Galaktose, Fruktose sowie Inulin und Ficoll 400) in Konzentrationen von 2–10 %. Für sämtliche qPCR-Experimente mit EvaGreen als Farbstoff bestimmten sie die Ct-Werte, machten Schmelzkurvenanalysen und schauten per Gel-Elektrophorese die Produkt-Zusammensetzung genau an. Ganz klar die Nase vorn hatte Sukrose.
Kaum Artefakte
Egal ob 2-, 4-, 6-, 8- oder 10-%ig dosiert, brachte eine „gesüßte“ Reaktion wesentlich mehr vom gewünschten Reaktionsprodukt (525 bp, hoher GC-Gehalt) hervor, ohne dabei nennenswerte Artefakte zu generieren. Der Ct-Wert lag hier um 4–6 Zyklen unter jenem der „Ohne-Enhancer“-Vergleichsreaktion. Andere „Enhancer“ führten dagegen entweder zu gar nichts (Ficoll) oder steigerten die Reaktionseffizienz auf Kosten von Nebenprodukten (z. B. DMSO, Mannose).
Bewährt sich der Top-Kandidat Sukrose aber auch bei anderen und größeren Herausforderungen? Experimente zur Amplifikation von unterschiedlich langen Fragmenten (342 bp, 525 bp, 1 kb, 3 kb) zeigen einen klaren Trend an: Sukrose verbessert die Effizienz der PCR bei hoher Spezifität (keine Artefakte). Je länger das Produkt jedoch, desto geringer ist die Verstärkerwirkung.
Andrea Pitzschke
Sakhabutdinova A. et al. (2020): Enhancement of PCR efficiency using mono- and disaccarides. Anal Biochem, 606:113858
Foto: Pixabay/moritz320
