Templates, die stabile Sekundärstrukturen wie zum Beispiel Haarnadel-Schleifen (Stem loops) bilden, sind bei der PCR echte Spielverderber. Trifft die Taq-Polymerase während der Verlängerung der Primer auf den Stamm einer Stem-loop-Struktur, wirkt dieser wie eine Schranke. Entweder beendet die Polymerase an dieser Stelle die Elongation frühzeitig und synthetisiert nur ein verkürztes Amplifikationsprodukt, oder sie setzt die Elongation nur mühsam und ineffizient fort.
In letzterem Fall entstehen zwar komplette Amplikons – die Ausbeute ist aber sehr dürftig. Hohe Werte für den Schwellenwertzyklus (Ct) bei der qPCR deuten nicht immer nur auf geringe Template-Mengen hin. Auch stabile Sekundärstrukturen können hierfür verantwortlich sein. Letztere sind auch ein Problem bei der Sanger-Sequenzierung, denn auch diese beruht auf dem klassischen PCR-Prinzip.
In silico oder DMSO
Was also tun? Mit In-silico-Vorhersagen, etwa mit dem Programm Mfold (https://bio.tools/mfold), kann man abschätzen, ob ein Template Probleme machen könnte. Manchmal genügt es dann bereits, die PCR-Bedingungen etwas zu variieren, etwa die Temperatur zu erhöhen. Wenn auch das nichts hilft, kann man dem Reaktionsmix Enhancer-Substanzen zusetzen, wie Betain oder DMSO, welche die Sekundärstrukturen auflösen sollen. Aber auch Betain und DMSO funktionieren nicht immer und oft genug bleibt ihr Enhancer-Effekt bei der PCR oder qPCR aus. Zudem läuft man Gefahr, die Taq-Polymerase zu inhibieren, wenn man es mit den Enhancern übertreibt.
Ein Forscherteam aus China hat sich deshalb eine andere Strategie überlegt, mit der man Stem-loop-Strukturen in PCR-Templates beseitigen kann: Die Chinesen eliminieren diese mit sogenannten Disruptor-Oligonukleotiden, die 20 bis 36 Nukleotide lang sind und keinerlei chemische Modifikation tragen.
Dreiteiliger Disruptor
Die Disruptoren sind Sequenz-spezifisch für die jeweilige Stem-loop-Struktur und müssen für jedes Template neu entworfen werden. Sie enthalten drei wesentliche Sequenz-Abschnitte: eine Anker-Sequenz am 5‘-Ende, einen Effektor im Mittelteil und einen 3‘-Blocker. Der Anker hybridisiert mit einem Abschnitt der Template-Sequenz, der unmittelbar an die Basis eines Stem loops heranreicht. Anschließend geht die Sequenz in den zum Stem und einem Stück des Loops passenden Effektor über. Die Sequenz des vier Nukleotide langen 3‘-Blockers passt dagegen nicht zum Template. Sie stellt sicher, dass die Polymerase den Disruptor nicht als klassischen Primer nutzt, und entsprechend elongiert. Damit die Disruptoren funktionieren, müssen sie in einem zehnfachen Überschuss gegenüber den eigentlichen Primern vorliegen.
Bei der PCR mit den Disruptoren binden die Primer nach der Denaturierung und Abkühlung an die anvisierte Sequenz des Templates. Gleichzeitig hybridisieren die Disruptoren mit ihrer Anker-Sequenz mit den Sekundärstrukturen des Templates. Im Elongationsschritt verlängert die Polymerase den Primer und synthetisiert den neuen Strang. Der Effektor des Disruptors dröselt hierbei die Sekundärstruktur auf und wird danach von der Polymerase verdrängt, die ihn schließlich mit ihrer 5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität sukzessive zerhäckselt (Gene, 764: 145095).
Die optimale Länge und Konzentration der Disruptoren kann je nach Template variieren. Eine Konzentration von 2 µM und eine Länge von 30 bis 36 Nukleotiden sind ein guter Orientierungswert, wobei Anker und Effektor etwa gleich lang sind. Längere oder stärker konzentrierte Disruptoren sind eher kontraproduktiv, da Dimere entstehen, die ihrerseits die PCR inhibieren können.
Sinkende Werte
Für die Entwicklung und Optimierung der Disruptoren haben sich die Chinesen zwei der schwierigsten PCR-Templates ausgesucht: Bestimmte Regionen des humanen EGFR-Gens sowie rekombinante AAV-Vektoren mit GC-reichen, invertierten terminalen Repeat-Sequenzen (ITRs). Wie gut die Disruptoren bei diesen wirken, zeigt ein Vergleich der Ct-Werte bei PCRs mit und ohne Disruptoren. Bei den relativ unproblematischen Abschnitten des EGFR-Gens stellte die Gruppe keine großen Unterschiede fest. Mit steigender Stabilität der Sekundärstrukturen zeigte sich jedoch der positive Effekt der Disruptoren. So sank der Ct-Wert in schwierigen Sequenz-Abschnitten mithilfe von Disruptoren von 32 auf 26, von 37 auf 31 sowie von 41 auf 35. Ein stark verdünntes Template, von dem nur zehn Kopien pro Reaktion vorlagen, konnte die Gruppe nur in Gegenwart von Disruptoren amplifizieren.
Mithilfe der Disruptoren gelang den Chinesen auch ein kleines Kunststück: Sie sequenzierten die Repeat-Sequenzen eines AAV-Vektors mit der Sanger-Sequenzierung.
Andrea Pitzschke
Liu Z. et al. (2021): Disruptors, a new class of oligonucleotide reagents, significantly improved PCR performance on templates containing stable intramolecular secondary structures. Analytical Biochemistry, 624:114169
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