Die einen visualisieren ihre Daten mit Heatmaps, die anderen mit Balkendiagrammen, die dritten belassen es bei nüchternen Tabellen. Wenn es um die Auswertung und Darstellung von Reportergen-Assays geht, ist die Vielfalt groß. Für Forscher, die sich am Ende einen Reim aus den publizierten Daten machen müssen, ist es daher oft sehr mühsam, sich in immer neue Darstellungsweisen hineinzufuchsen.
Die Gruppe des Spezialisten für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) Joachim Goedhart von der Universität Amsterdam überlegte sich, wie man insbesondere Rohdaten von komplexen Reporter-Assays mit einem Computer-Tool einfacher und präziser verarbeiten sowie visualisieren kann. Goedharts Team analysiert die Signalleitung durch die GPCR meist mithilfe von Fluoreszenz-markierten Reporterproteinen. Damit die Niederländer in dem Wirrwarr der vielen GPCR-Fluoreszenz-Reporter nicht den Überblick verlieren, entwarfen sie ein einfach zu handhabendes Webtool namens PlotXpress, das Daten von Reportergen-Signalen quasi auf Tastendruck in publikationsreife Grafiken überführt.
Verquickte Daten
Wie die Auswertung der Daten mit PlotXpress funktioniert, beschreiben die Forscher anhand eines dualen Luciferase-Assays mit den beiden Reportern Renilla-Luciferase und Firefly-Luciferase in einer 96-Well-Platte. Um die Lumineszenz-Daten in PlotXpress hochladen zu können, wird die Platte mit einem Mikroplatten-Lesegerät gescannt. Die niederländische Gruppe verwendete hierzu einen kommerziellen Reader, der die Lumineszenz-Signale im Tabellenkalkulations-Format (XLSC) speichert. Zusätzlich werden die experimentellen Bedingungen für jedes Well, etwa die eingesetzten Zellen und ihre Behandlung, mithilfe einer App als separate Tabelle im CSV-Format hochgeladen. PlotXpress wandelt das XLSC-Format in ein strukturiertes Datenformat (Tidy-Format) um und verquickt hierbei die Luminszenz-Daten mit den Daten der experimentellen Bedingungen. Die hieraus resultierenden Tidy-Daten verwendet PlotXpress schließlich für Verarbeitung und Visualisierung. Alternativ kann man die Daten auch direkt im Tidy-Format in PlotXpress hochladen.
PlotXpress normalisiert die hochgeladenen Lumineszenz-Daten anhand einer internen Kontrolle, etwa einem Reportergen dessen Expression von einem konstitutiven Promotor gesteuert wird. Hierzu ermittel das Webtool das Verhältnis der Signalstärken von Firefly- und Renilla-Luciferase und berechnet daraus einen Mittelwert für alle Messungen, die mit identischen experimentellen Bedingungen verknüpft sind. Anschließend quantifiziert PlotXpress die Veränderung der Reportergen-Expression, indem es das Firefly/Renilla-Verhältnis durch das Firefly/Renilla-Verhältnis unter Referenz-Bedingungen teilt.
Auch nützlich für die qPCR
Das Ergebnis wird als Dotplot-Grafik angezeigt, die sich als Bild- oder PDF-Datei speichern lässt. Die Plots zeigen jeden Messpunkt, wodurch Schwankungsbreiten und Ausreißer sofort zu erkennen sind. Der Mittelwert von Replikat-Proben wird als horizontale Linie dargestellt. Der Anwender kann bei der Darstellung zwischen absoluten Aktivitäten, zum Beispiel Expressionswerten (Firefly/Renilla) oder x-facher-Induktion wählen. Mithilfe von Filteroptionen kann man einzelne Messreihen in eine separate Grafik überführen oder ganz herausnehmen.
PlotXpress ist aber nicht nur auf Reportergen-Assays beschränkt. Im Prinzip lassen sich mit dem Webtool auch andere Daten auswerten, die man normalisieren und mit einer Referenz vergleichen muss – zum Beispiel qPCR-Daten.
Andrea Pitzschke
Brandorff E. et al. (2021): PlotXpress, a webtool for normalization and visualization of reporter expression data. bioRxiv, DOI: 10.1101/2021.07.08.451595
Bild: PlotXpress
