(07.07.2020) Als Ende der Neunzigerjahre das Konzept der Lipid Rafts für Aufsehen in der Gemeinde der Lipid- und Membranforscher sorgte, steckten Hochdurchsatz-Techniken, die heute mit dem Zusatz „-omik“ versehen werden, noch in den Kinderschuhen. Inzwischen hat sich auch die Lipidomik unter den Omiken etabliert und eröffnet insbesondere der Lipid-Analyse in der klinischen Forschung völlig neue Perspektiven.
Die Omik-Wissenschaften sind in den letzten Jahren stetig gewachsen. An der Spitze rangiert mit großem Vorsprung die Genomik mit mehr als 80.000 im Jahr 2019 publizierten Artikeln. Auf Platz zwei liegt die Proteomik mit 12.000 Veröffentlichungen, gefolgt von der Metabolomik mit 7.000 Papern.
Deutlich hinterher hinkt die später gestartete Lipidomik, die im letzten Jahr 1.100 Originalarbeiten zur Wissenschaftsliteratur beitrug. Lipide wurden mit Beginn der DNA-Revolution in den Siebzigerjahren links liegen gelassen. Nachdem sie lange Zeit eine zentrale Rolle in der Erforschung der Zellmembran inne hatten, blieb ihnen nur noch eine Rolle als Statisten. Die Hauptrolle spielten zunehmend Membranproteine – die Lipid-Doppelschicht war nur noch ein langweiliges Lösungsmittel für die in die Lipid-Matrix eingebetteten Proteine. Dieses traurige Schicksal hat sich jedoch gewandelt. Die knapp 600 in den Fettstoffwechsel involvierten Gene des menschlichen Genoms können nicht funktionslos sein. Viele dieser Gene codieren für Enzyme, die Membran-Lipide auf- und abbauen. Inzwischen wissen wir, dass die Zellmembran hunderte verschiedene Lipide enthält, die für ihre Funktion notwendig sind. Es wird immer offensichtlicher, dass wir Proteine und Lipide gemeinsam untersuchen müssen, um die Funktionsweise von Zellmembranen zu verstehen. Membranen sind die „Brutstätten“ vieler zellulärer Aktivitäten und spielen eine entscheidende Rolle in Zellen und Geweben.
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Beinahe ein Drittel aller Proteine sind Membranproteine. Zudem halten sich viele lösliche Proteine während ihres Lebenszyklus an der extra- oder intrazellulären Seite der Zellmembran auf und interagieren hier mit Transmembranproteinen. Viele zelluläre Funktionen sind Membran-gebunden. Mit der Zellmembran allein funktionieren die Proteine jedoch nicht – sie benötigen zusätzliche Unterstützung durch Lipide. Kein Wunder also, dass die Zahl der dokumentierten Wechselwirkungen von Proteinen mit Lipiden kontinuierlich ansteigt. Hierbei spielen viele Faktoren eine Rolle. Etwa die Dicke der Lipiddoppelschicht sowie die Länge der Transmembran-Domänen, die ein hydrophobes Mismatching der Membranproteine vermeidet, bei dem hydrophobe Proteinoberflächen einer wässrigen Umgebung ausgesetzt sind.
Spezifische Wechselwirkungen regulieren das Zusammenspiel von Proteinen und Lipiden in der Membran. Der Sättigungsgrad und die Länge der Acyl-Ketten in Lipiden müssen exakt auf die Physiologie der Zelle eingestellt sein. Mitentscheidend ist auch die asymmetrische Anordnung der Lipide in den beiden Blättern der Lipiddoppelschicht. Spezifische Flippasen transportieren die Lipide mit erheblichem Energieaufwand von einer Schicht in die andere, um ihre korrekte asymmetrische Anordnung aufrechtzuerhalten. Letztendlich wird die Qualität der Membran-Funktionalität mithilfe dieser Lipid-Protein-Interaktionen gesteuert.
Membranlipide ermöglichen und erleichtern auch den Membran-Verkehr innerhalb der Zelle. Die meisten Glycerolipide und Sterole werden im Endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert. Daneben tragen auch Mitochondrien, Peroxisomen und einige Organell-Membranen zur Synthese des zellulären Lipid-Spektrums bei. Die meisten Lipide werden durch Membran-Verkehr oder durch Transfer-Mechanismen, die Membrankontakte erfordern, von ihrem Herstellungsort in der Zelle weiter transportiert.
Unterschiedliche Studien kamen zu dem Ergebnis, dass die verschiedenen Zellmembranen untereinander Kontakt aufnehmen, um ihre Funktionen zu koordinieren. Mithilfe dynamischer Membran-Membran-Kontaktstellen wird die Lipid-Zusammensetzung der Membranen auf die Bedürfnisse der Zelle eingestellt. Der Metabolismus der Zelle wird auf diese Weise sehr strikt durch Zellmembranen co-reguliert, die als Sensoren und Koordinatoren fungieren.
Die Konzentration von Sterolen und Sphingolipiden steigt vom ER zur Oberfläche der Zelle an. Sterole, Sphingomyelin und Glycosphingolipide werden hauptsächlich im ER sowie im Golgi-Komplex synthetisiert und von dort fortlaufend zum Golgi-Apparat, zur Plasmamembran sowie zu den endozytotischen Pathways befördert.
Obwohl der Fokus von Studien zum Membran-Verkehr meist auf Proteinen lag, werden Lipide während der Bildung der Transport-Vehikel zusammen mit Proteinen sortiert. Daher ist es essentiell, Lipide als eigenständige molekulare Spezies zu quantifizieren – und nicht wie bisher die Gesamtheit der Lipid-Klassen –, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen. Hieraus resultiert jedoch ein Problem der Lipidomik: Es existiert nur ein rudimentäres Verständnis dafür, wie die vielen verschiedenen Lipid-Spezies in der Zelle synthetisiert und metabolisiert werden. Um die Multiomik-Analyse der metabolischen Wege auf das ganze Lipid-Spektrum ausdehnen zu können, muss die Lipidomik diese Wissenslücke schließen.
Eine der herausragendsten Eigenschaften der Zellmembran ist die Ausbildung dynamischer Nanodomänen, die auch als Lipid Rafts bezeichnet werden. Die Lipide in der Membran regulieren nicht nur die Fluidität der Doppelschicht: Sie begründen auch eine zweidimensionale Flüssigkeit, die der Membran-Matrix die Möglichkeit zur Phasentrennung verleiht. Durch diese Trennung formieren sich kondensierte Sphingolipid-Cholesterol-Plattformen (Rafts) in der sie umgebenden flüssigeren Lipid-Matrix. Welche Proteine mit den Rafts assoziiert sind und welche von den Lipid Rafts ausgeschlossen werden und sich von diesen trennen, hängt von den spezifischen physikochemischen Eigenschaften der Membranproteine ab. Den Lipid Rafts zugeneigte, raftophile Transmembranproteine minimieren die Aminosäuren-Oberfläche der hydrophoben Transmembran-Domäne. Hierdurch können sie sich in den dichter gepackten Sphingolipid-Cholesterol-Nanodomänen aufteilen. Das Vermögen, flüssige, funktionelle Plattformen dynamisch zu bilden, stattet Zellmembranen mit bemerkenswerten Eigenschaften aus und verleiht ihnen eine außerordentliche Fähigkeit zum Multitasking.
Zellmembranen, die verschiedene Phasen trennen, sind vermutlich schon früh in der Evolution entstanden. Die wachsende Zahl an Proteinen und Lipiden in Membranen führte zu neuen Membran-Funktionen in der Zelle. Damit dieses System funktionierte, mussten die chemischen Eigenschaften jedes Membran-Newcomers so angepasst werden, dass die gemeinsame Fähigkeit zur Phasentrennung erhalten blieb. So sind zum Beispiel mehr als dreißig Schritte für die Biosynthese von Cholesterol nötig. Das Molekül wird bei diesen nicht nur für seine Ordnungsfunktion in der Lipiddoppelschicht sowie für Interaktionen mit Proteinen optimiert. Sie dienen auch dazu, die Phasentrennung zu erleichtern. Die Vielfalt der heute bekannten Lipide könnte aus dem Grund entstanden sein, die Multifunktionalität der Zellmembran zu erhöhen.
Für die energiesparende Bildung von Lipid Rafts muss die entsprechende Lipid-Zusammensetzung der Membran nahe an einer Phasengrenze positioniert sein. Diese Forderung der Thermodynamik führt zu einer strikten Regulierung der Lipid-Zusammensetzung. Nur wenn diese gewährleistet ist, kann die Lipid-Mischung ihre Funktion in phasenseparierenden Membranen erfüllen.
Die klassische Arbeit von Brown und Goldstein enträtselte die fein abgestimmte Steuerung der Cholesterol-Menge in der Zelle. Vermutlich werden die meisten anderen Membranlipide ähnlich präzise reguliert. So gelingt es dem Organismus, die Zusammensetzung der Lipide in verschiedenen Zelltypen aufrechtzuhalten – und sie gleichzeitig auf die zu unterstützenden Membranfunktionen einzustellen. Wie dieses metabolische Netzwerk funktioniert, ist aber noch längst nicht verstanden.
Die Lipid-Analyse hat sich sehr stark gewandelt, um mit der Vielfalt der Lipide Schritt halten zu können. So wurden insbesondere neue Massenspektrometer entwickelt, um die verschiedenen Lipide in der Zellmembran zu analysieren. Hierzu zählen Hybrid-Tandem-Massenspektrometer wie zum Beispiel Quadrupole-Time-of-Flight- oder Ion-Trap-Orbitrap-Massenspektrometer sowie die seit kurzem eingeführten Trapped-in-Mobility-Spektrometer, die es ermöglichen, einzelne molekulare Spezies des Lipidoms zu quantifizieren. Diese Techniken haben die Lipid-Analytik revolutioniert.
Bei der standardmäßigen Massenspektrometrie (MS) von Lipiden nutzt man zwei verschiedene Methoden, die sich ergänzen: Die Lipide werden in der Regel zunächst chromatographisch getrennt, etwa mit der Flüssigchromatographie (LC), und danach in das Massenspektrometer injiziert. Im Gegensatz hierzu entwickelte Andrej Shevchenko zusammen mit meiner Gruppe am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik in Dresden eine Shotgun-Lipidomik-Plattform, bei der die Lipide ohne vorhergehende Trennung direkt in das Massenspektrometer eingespritzt werden. Sowohl die LC/MS als auch die Shotgun-Lipidomik erfassen ein breites Lipid-Spektrum. Letztere ist jedoch schneller und wird aufgrund des höheren Durchsatzes meist für großangelegte Studien eingesetzt. Darüber hinaus vermeidet die Shotgun-Lipidomik Matrix-Effekte: Im Gegensatz zur LC/MS treten alle Lipide in der gleichen Matrix in das Massenspektrometer ein, während die Lipide bei der LC/MS durch die chromatographische Trennung in verschiedenen Matrix-Umgebungen am Massenspektrometer ankommen, wodurch die Lipid-Quantifizierung beeinträchtigt wird. Dennoch detektiert die LC/MS mehr Lipid-Spezies, weil die chromatographische Trennung ungewünschte Hintergrund-Effekte sowie Ionen-Suppressionen verringert.
Wir führten die Shotgun-MS-Plattform ein, um Lipide in Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten hochaufgelöst analysieren zu können. Sie wurde von meiner 2012 in Dresden gegründeten Firma Lipotype übernommen, die sie für den Hochdurchsatz weiterentwickelte, mit dem tausende Proben analysiert werden können. Inzwischen wurde der analytische Ablauf vollständig automatisiert, wodurch sich die Reproduzierbarkeit erheblich verbesserte.
Eine wichtige Vorgabe für unsere Shotgun-Plattform waren quantitative Ergebnisse. Diese Lektion lernte ich sehr früh in meiner wissenschaftlichen Karriere. Ich studierte Medizin in Helsinki, wo ich auch promovierte. Mein Doktorvater war der klinische Chemiker Ralph Gräsbeck, der mithalf das Reproduzierbarkeits-Problem in der klinischen Diagnostik zu lösen: Assays von Proben eines bestimmten Patienten, etwa zur Bestimmung von Cholesterol im Plasma, lieferten in verschiedenen Kliniken unterschiedliche Resultate. Dieses weltweite Problem wurde in Dänemark, Finnland, Island, Norwegen und Schweden durch interne Standards gelöst, die für alle Assays in den klinischen Laboren eingesetzt wurden. Diese Länder etablierten ein zentrales System mit qualitätskontrollierten Standards, die auf die einzelnen Assays zugeschnitten waren. Nach und nach wurde diese Vorgehensweise auf der ganzen Welt übernommen und trug wesentlich zur Verbesserung der klinischen Diagnostik bei.
Erstaunlicherweise liegt die experimentelle Biologie in dieser Hinsicht noch weit zurück. Weil wir es vernachlässigt haben, quantitative, reproduzierbare und vor allem vergleichbare Methoden zu entwickeln, erleben wir derzeit eine Reproduzierbarkeitskrise [1]. Bei Lipidomik-Experimenten lässt sich eine reproduzierbare Quantifizierung durch interne Standards erreichen, die jeder zu analysierenden Probe zugegeben werden. Lipidomiker haben das Glück, dass diese Standards kommerziell erhältlich sind und einer pro Lipid-Klasse ausreicht. Natürlich könnte man in den Proben auch mehrere verwenden. Der Fehler bei nur einem Standard ist bei der Shotgun-Lipidomik jedoch gering und mehrere Standards würden das Ergebnis der Analyse nur unwesentlich verbessern. Der Variationskoeffizient liegt bei den meisten Lipid-Analysen bei gerade mal zehn Prozent – vorausgesetzt, dass die Methode korrekt durchgeführt wird, die Instrumente gut gewartet sind und sich das Labor an strikte Qualitätskriterien hält.
Unsere Shotgun-Lipidomik-Plattform ist sehr zuverlässig. Wir haben in Dresden Jahre damit verbracht, den Analyse-Prozess vom Start bis zum Ende zu perfektionieren, damit er die Vorgaben der Good Manufacturing Practice (GMP) erfüllt. Insbesondere die sogenannte Inter-Site-Reproduzierbarkeit als Maß für die Reproduzierbarkeit der Methode in verschiedenen Laboren oder auf unterschiedlichen Geräten ist hervorragend [2], was nicht selbstverständlich ist.
Interessant ist, dass die Lipid-Zusammensetzung in humanem Plasma offensichtlich den metabolischen Zustand einer Person widerspiegelt. Sie weicht bei vielen Krankheiten, wie zum Beispiel Diabetes-Typ 2 [3] und Herzkreislauf-Erkrankungen [4], von den Kontrollen ab. Immer mehr Studien legen den Schluss nahe, dass das Lipidom auf Veränderungen des Metabolismus reagiert, die mit einer Krankheit einhergehen. Interessanterweise spiegelt sich auch die Adipositas im Plasma-Lipidom wider. Die Adipositas wird zu einer immer größeren Belastung, da sie das Risiko für chronische Krankheiten wie Diabetes und Herzkreislauf-Erkrankungen erhöht. Sie führt zudem inzwischen zu mehr Krebserkrankungen als das Rauchen. Wir müssen deshalb Strategien entwickeln, mit denen sich die weitere Ausbreitung der Fettleibigkeit verhindern lässt. Die Lipidomik könnte hier eingesetzt werden, um zum Beispiel zwischen einer benignen und einer krankhaften Fettleibigkeit zu unterscheiden [5].
Im Grunde ist es erstaunlich, dass das Lipidom des Bluts die Verhältnisse in unseren Zellen und Geweben reflektiert, in denen die Lipid-Zusammensetzung sehr strikt reguliert wird. Da wir Lipide nicht direkt in der Plasmamembran bestimmen können, analysieren wir Lipide, die von Lipoproteinen im Plasma transportiert werden. Wie aber können Plasma-Lipide Auskunft darüber geben, was im Körper vor sich geht? Plasma-Lipoproteine agieren als Überwachungssystem, das dazu beiträgt, die Lipid-Zusammensetzung in unseren Geweben zu erhalten. VLDL-LDL-Lipoproteine werden in der Leber synthetisiert und liefern Cholesterol zu peripheren Zellen, die in ihren Plasmamembranen über einen LDL-Rezeptor-Aufnahme-Mechanismus verfügen. HDL-Lipoproteine arbeiten in die entgegengesetzte Richtung und holen Cholesterol von der Peripherie wieder zurück zur Leber. Lipoproteine verschieben in der Zelle aber nicht nur Cholesterol – wenngleich die Forschung sich hauptsächlich hierauf fokussiert hat. Sie enthalten auch die meisten anderen Lipide, die in Zellmembranen anzutreffen sind. Lipoproteine sind generelle Lipid-Transporter und spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Lipid-Zusammensetzung in Geweben, die für die Funktion der jeweiligen Zellmembran nötig ist. Unser Organismus benötigt sie als extrazelluläre Überwachungssysteme für Lipide sowie als Transport-Vehikel, die uns bis zu einem gewissen Grad von unserer Ernährungsweise unabhängig machen.
Die Lipidomik könnte sich hier als geeigneter Weg erweisen, mit dem man den Metabolismus im Körper verfolgen kann, um gesunde und kranke Zellen zu unterscheiden. Die quantitative Shotgun-Lipidomik ist zwar noch ein Nachzügler – sie hat aber bereits mächtig aufgeholt.
[1] Pulverer, „Reproducibility blues“, EMBO J. 34: 2721-24.
[2] Surma et al., “An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids”, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117(10): 1540-49.
[3] Fernandez et al., “Plasma Lipidome and Prediction of Type 2 Diabetes in the Population-Based Malmö Diet and Cancer Cohort”, Diabetes Care 43(2): 366-73.
[4] Tabassum et al., “Genetic architecture of human plasma lipidome and its link to cardiovascular disease”, Nat. Commun. 10: 4329.
[5] Gerl et al., “Machine learning of human plasma lipidomes for obesity estimation in a large population cohort”, PLoS Biol. 17(10): e3000443.
Kai Simons war Gründungsdirektor des Dresdner Max-Planck-Instituts für molekulare Zellbiologie und Genetik. Bis zu seiner Emeritierung im Jahr 2007 erforschte er insbesondere die Funktion der Zellmembran. Er entwickelte das Konzept der Lipid Rafts, die wie kleine Flöße in der Zellmembran schwimmen und als Organisationszentren für zelluläre Prozesse dienen. 2012 gründete er die Firma Lipotype.