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(09.06.2021) ULM: Hefegenetiker haben ein neues Detail der Polarisierung von Zellen beschrieben – und mussten dabei so manche Hypothese begraben.

Vom einfachen Prokaryoten bis zum Säugetier, von Pilzen bis zu Pflanzen: Polarisierung von Zellen ist in der Natur überall anzutreffen. Sie ist die Basis, damit Zellen sehr unterschiedliche Architekturen und Funktionen ausbilden können. Man denke an die langen Axone von Neuronen, die Epithelzellen der Epidermis und der Darmschleimhaut, und ja – auch an Stammzellen, die sich asymmetrisch teilen. Das bekannteste Beispiel aus der Welt der Pflanzen ist wohl der mehrere Millimeter oder Zentimeter lange Pollenschlauch, durch den der Pollen sein Erbgut zur tief in der Narbe versteckten Eizelle schickt.

Die eher rundlichen Zellen der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) aber würden einem vermutlich erst einmal nicht im Zusammenhang mit Polarität einfallen. Doch Hefen entwickeln eine deutlich elliptische Form, die bei der Ausknospung der Tochterzelle durch das bevorzugte Wachstum an der Knospenspitze entsteht. Seit zig Jahren ist die schnell wachsende und genetisch leicht zu manipulierende Hefe daher ein Modellsystem, um die Polarität zu untersuchen. Woher weiß die Zelle, an welcher Stelle sie sich länger strecken soll? Und welche Moleküle sind dafür nötig?

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Dieser Frage geht in Ulm die Arbeitsgruppe von Nils Johnsson nach. Schon seit vielen Jahren arbeitet der Biochemiker mit Hefen, weil er in ihr Proteine im Kontext der Polarisierung vergleichsweise einfach studieren könne, wie er berichtet. „Man weiß schon viel über die sehr frühen Stadien der Knospenbildung und man kennt auch etliche daran beteiligte Proteine“, so Johnsson. Dennoch konnten die Ulmer diesem Wissen ein Detail hinzufügen. Die Basis dafür war lehrbuchmäßige Hefegenetik.

Im Zentrum des polarisierten Wachstums steht bei der Bäckerhefe – wie auch bei den meisten anderen Eukaryoten – die kleine, zur Rho-Familie gehörende GTPase Cdc42 beziehungsweise deren Homologe Rac bei Tieren, Rop bei Pflanzen. Cdc42 gehört zu den extrem konservierten GTPasen. Ihre Funktion ist es, Energie durch die Spaltung von GTP zur Verfügung zu stellen. Das meiste Cdc42 befindet sich bei Hefezellen in deren Membranen. Will die Hefezelle eine Tochterzelle bilden, aktiviert sie Cdc42 lokal in der G1-Phase des Zellzyklus, und genau dort entsteht dann die Keimzelle für die Polarisation. Es folgt die Bildung der Knospe in der G2-Phase und endet mit der Abschnürung der Tochterzelle.

Ebenso essenziell wie Cdc42 sind für das Spitzenwachstum die Moleküle Pea2 und Spa2. Schon 1996 hatten die US-amerikanischen Hefegenetiker Nicole Valtz und Ira Herskowitz festgestellt, dass Hefen nicht mehr polarisiert wachsen, wenn eines der beiden Proteine nicht funktioniert (J. Cell Biol. 135(3): 725-39). Die Forscher vermuteten damals, dass die Interaktion von Pea2 und Spa2 für das Budding Pattern, das Knospungsmuster, nötig sei. Sie lagen damit völlig richtig.

Heute kennt man viel mehr beteiligte Moleküle und weiß, wer mit wem interagiert – verstanden ist der Prozess aber noch längst nicht wirklich. An der Stelle, an der die Knospe für die Tochterzelle entstehen soll, bildet sich ein Multi-Protein-Komplex, das Polarisom. „Polarisome enthalten viele verschiedene Proteine in unterschiedlicher Zahl und verschiedenen stöchiometrischen Verhältnissen“, stellt Johnsson fest. Aha, man findet sich in dem Proteingewusel also noch nicht so richtig zurecht. Was man weiß: Zu den Polarisom-Proteinen gehören Cdc42 sowie die Gerüstproteine Pea2 und Spa2. Sie versammeln sich an der Innenseite der Zellmembran und organisieren dort weitere Moleküle wie beispielsweise das Formin Bni1 sowie Bud6, das für die Initiation von Aktinfilamenten nötig ist. Entlang der neu geschaffenen Filamente karrt das Motorprotein Myo2 Baustoffe für die neue Zellmembran in Form von Vesikeln heran.

Interessanterweise bewegt sich Myo2 nicht nur entlang des Aktins Richtung Polarisom, sondern bleibt dort auch sitzen. Offensichtlich hat es eine weitere Funktion. Auf dessen Spur begab sich die Arbeitsgruppe in Ulm. Die Hefegenetiker hatten bereits eine Plattform für das Screenen von Protein-Protein-Interaktionen geschaffen. Damit suchten sie nun systematisch nach Molekülen, die sich mit Myo2 verbinden (J. Cell Biol. 220(5): e202006193). Schnell waren etliche Kandidaten gefunden. „Der verheißungsvollste war Pea2“, berichtet Alexander Dünkler, der Johnsson jahrelang zur Seite stand und inzwischen einen Industriejob hat. „Mit der Identifizierung dieser Interaktion begann die arbeitsintensive Phase.“

Wieso das? Eine Knock-out-Mutante in Hefe herzustellen, um den Phänotyp „rund statt elliptisch“ zu überprüfen, ist doch kein Hexenwerk. „Knock-outs helfen uns bei solchen Fragestellungen nicht mehr weiter“, so Johnsson. „Oft führen sie zu einem Status, den ich mit einem Multiorganversagen vergleiche. So was ist nicht sehr informativ, denn wir können dann eben nicht sagen, wo genau das Problem entstanden ist. Allele mit definierteren Phänotypen sind viel aufschlussreicher. Allele sind sozusagen die Diamanten der Hefeforschung: selten und wertvoll.“

Also erzeugte das Forschungsteam Myo2-Varianten, bei denen zwar die Interaktion mit Pea2 gestört ist, aber Partnerschaften mit anderen Molekülen, soweit man sie kannte, nicht davon in Mitleidenschaft gezogen wurden. „Nur auf diese Weise lässt sich der Phänotyp tatsächlich auf die Störung der Partnerschaft von Myo2 und Pea2 zurückführen“, sagt Johnsson. Die Pea2-Bindungsstelle fand man schließlich an der Myo2 Cargo-Binding Domain (Myo2-CBD). Diese besteht aus drei kleineren Regionen, Pea2 benötigt nur die Region 1. „Wir haben in dieser Region dann über zwanzig Punktmutationen gesetzt und das Bindungsverhalten der Moleküle untersucht. Als essenziell stellte sich ein Arginin an Position 1419 heraus“, geht Dünkler ins Detail. Tauscht man diese Aminosäure aus, kann Myo2 nicht mehr mit Pea2 wechselwirken. Pea2 hingegen benötigt für den Kontakt mit Myo2 seine Aminosäuren an den Positionen 221 bis 350.

Die Forscher vermuteten nun, dass Myo2 seinen Partner Pea2 entlang der Aktinfilamente zum Polarisom transportiert. Und tatsächlich waren in der zeitaufgelösten Mikroskopie die Moleküle simultan anzutreffen, und zwar dort, wo sich im weiteren Verlauf am Cortex der Mutterzelle die Knospe entwickeln wird. Zu ihrem großen Erstaunen beeinflusste die 1419-Mutation dieses Verhalten aber nicht: sowohl Pea2 wie auch andere zum Polarisom gehörende Moleküle (Spa2, Bni1) waren am Mutterzelle-Cortex und später an der Membran der Knospe zugegen, allerdings nicht in einer so fokussierten Form, sondern eher verstreut. Pea2 kann also auch ohne das Motorprotein dorthin gelangen. Das passte nicht zur Hypothese, also dachten die Ulmer Genetiker erneut nach.

Zunächst testeten sie in vivo, ob die Bindung von Myo2 an Aktin wirklich nötig ist und ob die Verbindung zwischen Myo2 und Pea2 stark genug hält, um größere Komplexe und Partikel entlang der Aktinkabel zu bewegen. Die Antwort in beiden Fällen: Ja!

Myo2-Mutanten, die sich durch eine reduzierte Affinität zu Aktin auszeichnen, blieben rund und enthielten viele verteilt liegende Polarisom-Nano-Komplexe (PNCs). Damit war klar: Die Bindung von Aktin an Myo2 ist für die Entstehung eines funktionsfähigen Polarisoms unbedingt nötig. Für die Überprüfung des Pea2-Transports stattete die Forschungsgruppe die Peroxisomen der Hefezellen mit Pea2-Proteinen aus. Die Organellen integrierten die Moleküle in ihre Oberflächenmembranen und wurden daraufhin zur Knospenspitze befördert.

Die Größe des Polarisoms bestimmt die Stelle an der Zellmembran, in die sich Vesikel hineinfusionieren können, und damit auch die Form der entstehenden Knospe. Damit diese elliptisch wird, muss das Polarisom entgegen der kontinuierlichen Expansion der Zelloberfläche seine kompakte Form bewahren. Den festen Zusammenhalt bewerkstelligen vermutlich Aktinfilamente, die vom Polarisom aus generiert und verlängert werden. Johnsson: „Das ist unsere Hypothese: Wir denken, Myo2 und Pea2 werden benötigt, um das Polarisom zusammenzudrücken.“ Der Myo2-Pea2-Komplex könnte demnach PNCs, die sich in der Nachbarschaft des Polarisoms gebildet haben, in dessen Zentrum ziehen. Aber vielleicht ist es auch ganz anders. Vielleicht bewirkt die Myo2-Pea2-abhängige Bewegung der PNCs auf ein Zentrum hin eine solche Verdichtung der Gerüstproteine, dass diese in einem Akt der Phasentrennung das Polarisom erzeugen. Da kann Johnsson noch viel experimentieren. Will er auch. „Ich sehe zwar schon am Horizont die Pensionsgrenze, kann aber echt noch nicht ans Aufhören denken“, gibt er zu. „Für mich ist Wissenschaft wie eine Droge.“ Also dann wünscht LJ weiterhin viel Genuss an diesem Rausch!