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(06.04.2020) HOMBURG: Lipidmembranen sind essenziell für jede Form von Leben. Ihre Viskosität wird deshalb von den Zellen genau reguliert. Was diese dafür messen, war für Membranforscher eine Überraschung.
Biomembranen sind in der Welt des Lebendigen allgegenwärtig. Trotz ihrer vielfältigen Funktionen ist ihr Grundaufbau immer gleich – zumindest bei Eukaryoten und Bakterien. Deren Membranen bestehen aus Phospholipid-Doppelschichten, in denen Proteine „schwimmen“ können. Wie gut, hängt von der Membranviskosität ab – wie Robert Ernst, Professor für Molekulare Membranbiologie an der Universität des Saarlandes in Homburg, erklärt: „Man kann sich vorstellen, dass die Viskosität dem Kehrwert der Fluidität entspricht, also der Fähigkeit von Membranen zu fließen.“
Äußere Faktoren können die Viskosität beeinflussen: So drohen Biomembranen beispielsweise bei Kälte oder hohem Druck zu „erstarren“ und ihre Funktionsfähigkeit zu verlieren. Zellen können hier gegensteuern, indem sie die Zusammensetzung ihrer Lipide verändern. Während Lipide mit gesättigten Fettsäuren, also ohne Doppelbindungen, dicht gepackt vorliegen und deshalb eher dazu tendieren, zähflüssige, gelartige Membranen zu bilden, machen ungesättigte Fettsäuren Membranen flüssiger. Insbesondere gilt dies für gewinkelte Fettsäuren, die durch eine Doppelbindung in cis-Konformation einen Knick aufweisen.
Woher eine Zelle überhaupt weiß, wie es um die Viskosität ihrer Membranen bestellt ist, hat die Doktorandin Stephanie Ballweg aus der AG Ernst in enger Zusammenarbeit mit einem interdisziplinären Forscherteam aufgeklärt und dabei alte Vorstellungen über Bord geworfen. „Seit mindestens fünfzig Jahren gab es die allgemeine Annahme, dass Zellen die Fluidität ihrer Membranen direkt messen und regulieren. Dabei war das nie wirklich getestet worden“, sagt der Biochemiker Ernst und erklärt auch gleich, warum die Arbeiten so schwierig sind: „Erstens sind biologische Membranen überaus komplex und bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Lipide und Proteine. Zweitens ist im Lipidmetabolismus alles mit allem verbunden. Und drittens sind die biophysikalischen Membraneigenschaften voneinander abhängig und stehen zueinander oft in einem unbekannten Verhältnis. Wenn man in ein solch komplexes System eingreift, weiß man nie genau, woher der Effekt kommt, den man beobachtet, und was er bedeutet.“
Den Grund für den Erfolg seines Teams sieht Ernst vor allem in der Interdisziplinarität: „Unser Team besteht aus theoretischen Physikern, Biochemikern und Zellbiologen.“ Dazu kommt, dass den Homburger mit fast allen Co-Autoren langjährige Freundschaften aus seiner Zeit in Dresden und Frankfurt verbinden. Freundschaften als Triebkraft der Forschung? „Ja“, bestätigt Ernst, „sich gut zu kennen und Zeit zu investieren, ist bei interdisziplinärer Arbeit besonders wichtig. Man muss viel miteinander reden, um Missverständnisse zu vermeiden. Da ist es enorm hilfreich – und es macht Spaß.“
In der nun mit einem Nature-Communications-Paper (11: 756) gekrönten Arbeit beschäftigten sich die Forscher mit dem Membransensor und Transkriptionsaktivator Mga2 aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Mga2 durchspannt mit einer Helix die Membran des Endoplasmatischen Retikulums. Nimmt die Membranfluidität ab, sorgt Mga2 dafür, dass mehr von einem Enzym gebildet wird, das jeweils eine cis-Doppelbindung in die Fettsäureschwänze einfügt – die Membran wird flüssiger.
„Schon die Arbeitsgruppe Garfinkel in den USA und das Team um Stefan Jentsch vom Max-Planck-Insitut (MPI) für Biochemie in Martinsried hatten gezeigt, dass Mga2 wichtig für den Fettsäurehaushalt ist“, erläutert Ernst. „Aber erst mein ehemaliger Postdoktorand Claudius Stordeur hat mich davon überzeugt, dass das Protein möglicherweise selbst als Sensor fungieren könnte.“ Wie der Sensor funktioniert und was er misst, blieb aber vorerst unklar.
Eine erste Idee hatten die Forscher ziemlich schnell: „Mitten in der Transmembrandomäne von Mga2 befindet sich ein Tryptophan. Das ist ziemlich ungewöhnlich.“ Ein weiterer Hinweis kam von molekulardynamischen Simulationen von Roberto Covino aus der Arbeitsgruppe um Gerhard Hummer vom MPI für Biophysik in Frankfurt am Main: Mga2 bildet Dimere, die sich ständig umeinander drehen. Dabei können die ungewöhnlich platzierten Tryptophane im Dimer entweder zueinander oder voneinander weg zeigen. Könnte dies eine Art An- beziehungsweise Ausschalter für den Transkriptionsaktivator sein? Ein Aminosäureaustausch zeigte, dass die Wissenschaftler auf der richtigen Fährte waren. Insbesondere wenn Tryptophan durch das kleine Alanin ersetzt wurde, kam es zu einem vollständigen Funktionsverlust von Mga2. „Dieses Ergebnis hat uns motiviert, viel Arbeit in den Aufbau eines In-vitro-Systems zur Analyse von Mga2 zu stecken“, so Ernst.
Nature-Communications-Erstautorin Stephanie Ballweg (li.) aus der AG von Robert Ernst (mi.) mit Kollegin Milka Doktorova (re.) aus den USA. Fotos: Privat (li. und re.); Uwe Dettmer/Goethe-Universität Frankfurt (mi.)
Dreh- und Angelpunkt dabei war ein ausgeklügelter Minimalsensor, der hauptsächlich aus der Transmembrandomäne von Mga2 mit dem ungewöhnlichen Tryptophan sowie einer davor gelegenen, flexiblen Schleife bestand. Letztere enthält eine Bindestelle für eine E3-Ubiquitinligase und drei Lysinreste, die durch die Übertragung von Ubiquitin als Signal dienen, das Protein durch ein Proteasom zu schneiden und dadurch zu aktivieren. Mithilfe der Ubiquitin-Übertragung lässt sich daher nachweisen, ob Mga2 aktiv ist. Zusätzlich trug der Minimalsensor am N-Terminus eine Dimerisierungsdomäne und einen Tag zur Reinigung und zum Nachweis.
In Liposomen mit unterschiedlicher Lipidzusammensetzung eingebracht zeigte sich wie erwartet, dass der Sensor nur in Membranen mit einem erhöhten Anteil an gesättigten Fettsäuren aktiv ist. Mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) konnten Ernst und Kollegen schließlich aufdecken, dass unter diesen Bedingungen die Bindestelle der E3-Ubiquitinligase und die Ubiquitinylierungsstellen näher aneinanderrücken.
Mit zunehmendem Anteil an gesättigten Fettsäuren sinkt die Membranfluidität. Um herauszufinden, ob der Sensor tatsächlich wie allgemein angenommen die Fluidität misst oder doch eher den Sättigungsgrad der Membran, nutzten die Forscher aus, dass auch die Lipidkopfgruppen die Fluidität beeinflussen. Indem sie Phosphatidylcholin teilweise durch Phosphatidylethanolamin ersetzten, konnten sie Membranen mit unterschiedlicher Fluidität, aber gleichem Sättigungsgrad herstellen. Tatsächlich korrelierte das FRET-Signal nun nicht mehr mit der Fluidität, sondern allein mit dem Sättigungsgrad. Die fünfzig Jahre herrschende Annahme, die Zelle messe die Fluidität, begann langsam zu bröckeln.
Elektronenspinresonanz-Spektroskopie-Versuche bestätigten: Die beiden Tryptophane des Mga2-Dimers sind im gesättigten Umfeld öfter zueinander hin orientiert als in einem weniger gesättigten Umfeld. Interessanterweise liegen die Tryptophane auch genau in dem Membranbereich, in dem sich die für die Bäckerhefelipide typische cis-Doppelbindung befindet. „Wir spekulierten, dass Mga2 vielleicht speziell an dieser Stelle die Lipidpackungsdichte messen könnte“, erklärt Ernst.
Um diese Vermutung zu prüfen, hatte die Co-Autorin Milka Doktorova an der Universität von Texas in Houston, USA, eigens ein Verfahren zur Darstellung von molekulardynamisch simulierten Membranen entwickelt. „Das war ein grandioser Moment! Milka konnte zeigen, dass die lokale Atomdichte in der Membran ausschlaggebend ist – und zwar speziell in dem Bereich, in dem die Tryptophane liegen“, fasst Ernst zusammen. So kann der Sensor zwischen gesättigten und ungesättigten Fettsäuren unterscheiden. Die alte Lehrmeinung war damit widerlegt.
Ernst veranschaulicht das Ergebnis gerne mit einem Bild: „In der Membran wirken Drücke und Spannungen von mehreren hundert Bar auf Membranproteine. Deshalb halten Biophysiker gerade das laterale Druckprofil für ausschlaggebend für die Dynamik und Funktion von Membranproteinen. Wenn wir uns aber einen Menschen anschauen, der im Wasser läuft oder schwimmt, kommt der Schwimmer deutlich schneller vorwärts. Dabei bleibt der Wasserdruck in beiden Fällen gleich. Entscheidend ist also nicht der Druck, der auf den Menschen wirkt, sondern wie viele Wassermoleküle verdrängt werden müssen.“ Ganz ähnlich ist es mit dem Sensor, der in der Membran schwimmt.
Die größere Packungsdichte von Atomen im Bereich der Tryptophane von Mga2 führt dazu, dass diese sich im Inneren des Dimers „verstecken“. Je größer die Aminosäure an diesem Ort ist, desto größer die Sensitivität des Proteins. Daher hat ein Austausch von Tryptophan zu Alanin auch gravierende Folgen.
„Unser Verständnis vom Einfluss verschiedener Membraneigenschaften auf die Struktur und Funktion von Proteinen steht noch am Anfang“, räumt der Forscher ein. Persönlich interessiere ihn besonders, wie die extrem kleinen Unterschiede in der Dynamik von Mga2 ein robustes An- und Aussignal erzeugen können. „Die Häufigkeit, mit der die Tryptophane zueinander zeigen, erhöht sich in einer eher gesättigten Membran nur um 10 bis 15 Prozent. Das ist nahe am thermischen Rauschen. Wir haben strukturelle Hinweise, dass dieses Rauschen herausgefiltert werden kann und dass das spezifische Signal verstärkt wird. Je weiter wir uns im Sensor von der Membran wegbewegen, desto größer wird der strukturelle Einfluss der Lipidumgebung auf das Protein.“
Den Minimalsensor möchten die Homburger nun weiterentwickeln, um mit seiner Hilfe die Homöostase von Membranen unter verschiedenen Bedingungen, etwa bei Hitze- oder Kältestress, zu erforschen. Da sich die ER-Membran stark von der Plasmamembran und anderen Organellmembranen unterscheidet, geht Ernst außerdem davon aus, dass noch weitere Sensoren ihrer Entdeckung harren. Gut möglich, dass die Interdisziplinarität seines Teams bald wieder gefragt ist.