Maßnehmen mit FRET

Neues FRET-System

Andrea Kienzler und Anika Ahrens

Fluoreszenzfarbstoffe sind nicht nur schön anzusehen. Mit etwas Geschick kann man mit ihnen auch molekulare Zollstöcke herstellen.

Bei einem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) überträgt ein durch Licht angeregter fluoreszierender Farbstoff (Fluorophor) Energie auf einen zweiten Fluorophor, der sich im Grundzustand befindet. Der deutsche Physiker Theodor Förster beschrieb dieses Phänomen bereits 1946, Wissenschaftler sprechen deshalb auch häufig von Förster-Resonanz-Energie-Transfer. Den angeregten Fluorophor bezeichnet man als Donor, den Empfänger der Energie als Akzeptor. Der Donor überträgt die Energie strahlungsfrei durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, wobei der Energietransfer maximale Werte erreicht, wenn der Akzeptor in dem Spektrum des Lichts absorbiert, in dem der Donor emittiert. Aber auch der Abstand der beiden Farbstoffe, ihre Orientierung zueinander und der Grad der Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Donors und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors spielen eine entscheidende Rolle für die Intensität des erhaltenen FRETs.

Das FRET-Phänomen war lange Zeit nur Photochemikern und theoretischen Physikern ein Begriff. In den letzten Jahren hielt die FRET-Analyse aber auch in die Labore von Biowissenschaftlern Einzug und immer mehr Bioanalytik-Kits basieren auf dem FRET-Prinzip. Das liegt zum einen daran, dass die für einen FRET nötigen Distanzen von 10 Å bis 100 Å in der Größenordung von biologischen Makromolekülen liegen. Zum anderen verstärkt sich der Energietransfer schon bei kleinsten Abstandsänderungen der beiden Farbstoffmoleküle oder schwächt sich entsprechend ab. Wissenschaftler setzen FRET-Analysen deshalb häufig als spektroskopisches Lineal ein, mit dem sie Entfernungen zwischen Biomolekülen messen und die Wechselwirkungen der Moleküle in Echtzeit verfolgen.


Ein wichtiger FRET-Parameter ist der Förster-Radius, der angibt, bei welchem Abstand von Donor und Akzeptor die Effizienz der Energieübertragung auf die Hälfte gesunken ist. Wenn der Donor die Energie komplett an den Akzeptor weitergibt, verschwindet seine Emissionsbande und stattdessen taucht die des Akzeptors auf. Aber auch bei nicht vollständiger Energieübertragung lässt sich die Qualität des FRETs entweder über die Abnahme der Donor- oder über die Zunahme der Akzeptor-Emission bestimmen.

Das Entscheidende bei der FRET-Spektroskopie sind geeignete Farbstoffe. Hierbei unterscheidet man zwischen organischen und natürlichen Fluorophoren. Zu letzteren gehören, neben enzymatischen Cofaktoren und natürlichen Aminosäuren, insbesondere fluoreszierende Proteine wie das Grün-fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle A. victoria. Mittlerweile existieren zahlreiche Varianten fluoreszierender Proteine, die sich durch ihre Absorptions- und Emissionsspektren unterscheiden.

Fluoreszierende Proteine eignen sich besonders als FRET-Farbstoffe, weil sie relativ klein sind. Ihre DNA lässt sich deshalb einfach mit der DNA eines gewünschten Genes fusionieren und anschließend als Fusionsprotein exprimieren. Cyaninfarbstoffe, die man ebenfalls in FRET-Systemen einsetzt, sind nicht immer optimal, weil sie zum Beispiel weniger photostabil sind.

Unsere Arbeitsgruppe (die AG Bannwarth in Freiburg) besteht überwiegend aus organischen Chemikern, und als Organiker hat man natürlich den Ehrgeiz FRET-Farbstoffe selbst zu entwickeln und zu synthetisieren. Inzwischen haben wir zahlreiche Chromophore hergestellt, die mit ihren unterschiedlichen Absorptions- und Emissionswellenlängen einen großen Teil des Spektrums, von ultraviolettem bis sichtbarem Licht, abdecken.

Für unsere FRET-Analysen von Peptiden oder DNA verwenden wir ein FRET-System aus einem Carbostyril-Derivat (FRET-Donor) und einem Ruthenium (Ru)-Bathophenanthrolin-Komplex (FRET-Akzeptor). Biologen sollten nicht zu sehr über die exotisch klingenden Namen der beiden Farbstoffe und deren Strukturen erschrecken. Viele haben vermutlich schon mit Ru-Bathophenatrolin-Komplexen gearbeitet ohne es zu wissen. Denn die häufig für die Fluoreszenzmarkierung von Proteinen in Gelen benutzten Farbstoffe SYPRO Ruby oder [Ru(Bpds)3]Cl2 sind nichts anderes als metallorganische Rutheniumkomplexe. Die Anregungsspektren der beiden Farbstoffe überlappen sich. Zudem sind sie chemisch und thermodynamisch besonders stabil und lassen sich sowohl in DNA als auch in Peptide einbauen.

Dieses neue FRET-System setzten wir bereits 2005 erstmals in einem Protease-Assay für Thrombin ein. (Kainmüller et al. Chem. Commun., 2005, 5459–5461). Dazu konstruierten wir Peptide mit dem Donor an einem Ende und dem Akzeptor am anderen. Durch die enzymatische Spaltung wurde der FRET aufgehoben und wir konnten die Aktivität des Enzyms messen.


Interaktions-Signal

Mit dem gleichen FRET-System untersuchten wir auch DNA-Protein-Interak­tionen (Altevogt, et al. Org Biomol Chem. 2009, 7, 3934-9). Dazu synthetisierten wir eine mit dem Donor markierte zurückgefaltete DNA, die zusätzlich eine Bindungsstelle für das Protein NF-κB trug. An diese DNA kann sich via Hoogsteen-Paarung eine kurze, Akzeptor-markierte DNA-Sequenz anlagern. In Abwesenheit von NF-κB bildet sich eine Tripel-Helix aus, wodurch sich die Chromophore annähern und ein FRET auftritt. Gibt man NF-κB zu, so wird die Akzeptor-DNA verdrängt, der Abstand zwischen den Chromophoren vergrößert sich und das FRET-Signal schwächt sich ab.

In einem kürzlich erschienenen Paper beschreiben wir, wie sich die FRET-Intensität verändert, wenn man den Abstand zwischen den Chromophoren variert (Flehr et al., Bioconjugate Chem. 2010, 21, 2347-54). Hierzu synthetisierten wir verschiedene DNA-Stränge mit dem Akzeptor am 5´-Ende. Die Position des Donors veränderten wir von Strang zu Strang. Um für die FRET-Messungen eine klar definierte Struktur zu erhalten, hybridisierten wir die DNA mit den jeweils komplementären DNA-Strängen. Über den Abstand der Basenpaare in doppelsträngiger DNA von etwa 3,4 Å erhält man eine relativ gute Korrelation zwischen Abstand und Effizienz des FRETs. Die Emission des Donors verringerte sich hierbei mit kleiner werdendem Abstand zwischen den Farbstoffen. Gleichzeitig nimmt die Emission des Akzeptors zu (der Förster-Radius betrug in diesem Fall etwa 37 Å).


Nicht linear

Wir berechneten die FRET-Effizienz sowohl über die gemessene Emission des Donors als auch über die des Akzeptors bei verschiedenen Abständen der Chromophoren zueinander. Dabei stellte sich heraus, dass die Emmision mit zunehmendem Abstand nicht linear abnimmt, wie man im ersten Moment erwarten würde. Dies leuchtet jedoch ein, wenn man den tatsächlichen Abstand der Chromophore betrachtet, der aus der helikalen Struktur der DNA resultiert. So können Chromophore, die nur durch wenige Basen auseinandergehalten werden, in einer größeren räumlichen Entfernung zueinander stehen als solche, die durch eine größere Anzahl Basen getrennt sind. Dies ist zum Beispiel dann der Fall, wenn erstere auf verschiedenen Seiten der Doppelhelix liegen und dadurch räumlich weiter voneinander entfernt sind.

Momentan versuchen wir Dreifarben-FRET-Systeme zu entwickeln. Bei diesen führt man einen weiteren Chromophoren ein, der im Emissionsbereich des Akzeptors absorbiert und selbst bei höherer Wellenlänge emittiert. Durch den dritten Chromophor vergrößert sich der spektrale Messbereich und man kann die Wechselwirkungen von drei mit Farbstoffen markierten Molekülen beobachten und zusätzlich ihre Ortsorientierung zueinander verfolgen.



Letzte Änderungen: 23.05.2011