Mit molekularbiologischen Methoden kann man im Handumdrehen zigtausende Proteinvarianten herstellen. Die Analyse der Mutanten geht dann aber meist nur schleppend voran, und oft genug muss man Kolonien noch von Hand picken. Mit einem selbstgebauten Kolonien-Picker wird das Mutanten-Screening jedoch zum Kinderspiel.
Dank moderner DNA-Technologie ist es kein Hexenwerk mehr, durch gelenkte Evolution Proteine mit neuen Eigenschaften herzustellen. Entwickelt wurde die Methode von der amerikanischen Forscherin Frances Arnold, die im Oktober dafür den Chemie-Nobelpreis erhielt.
Obwohl die Techniken für die zielgerichtete Protein-Evolution etabliert sind, gibt es noch einige Hürden zu überwinden. Vor allem die Validierung und Auswahl geeigneter Protein-Kandidaten aus großen Mutanten-Bibliotheken hat es in sich. Händisches Picken der Kolonien ist langsam, mühsam und fehleranfällig. Automatisierte Kolonien-Picker existieren zwar, sind aber teuer und unflexibel. Für Fluoreszenzanalysen sind sie zumeist nicht geeignet. Außerdem ist es nicht möglich, die Zusammensetzung der Bibliothek zu verschiedenen Zeitpunkten des Evolutionsprozesses zu analysieren. Kurz gesagt: Für ProteinEngineering sind die bislang verfügbaren automatischen Lösungen nicht wirklich geeignet.
Für die Gruppe des Neurowissenschaftlers Oliver Griesbeck vom Max-Planck-Institut für Neurobiologie in Martinsried war dies jedoch kein Grund, die Flinte ins Korn zu werfen. Sie konstruierte eine automatisierte Screening-Plattform, die fluoreszierende Protein-Varianten aus Bakterienkolonien pickt (Cell Chem Biol: S2451-9456(18) 30274-5).
Der Kolonien-Picker ist in einen simplen rechteckigen Kasten aus lichtundurchlässigen mitteldichten Faserplatten (MDF-Platten) integriert, die man in jedem Baumarkt erhält. Die Box ist 60 Zentimeter hoch, 50 Zentimeter breit und genauso tief (siehe auch die entsprechende Schemazeichnung). Auf dem Deckel ist ein CCD-Kamerasystem angebracht, das Bakterienkolonien auf Agarplatten oder Blot-Membranen abbildet. Agarplatten werden auf einer MDF-Platte mit kreisförmigem, durchsichtigen Probentisch in der Mitte, platziert, die wenige Zentimeter über dem Boden des Kastens eingeschoben ist. Auf der Unterseite des Deckels sind LED-Lampen kreisförmig angeordnet, welche die Agarplatten von oben mit verschiedenfarbigem LED-Licht beleuchten. Eine kleine LED-Lampe auf dem Boden des Kastens leuchtet die Platten von unten mit weißem Licht aus.
Die dreidimensionale Steuerung des Picker-Arms übernimmt ein Delta-Roboter, dessen dreiarmiges Design die Gruppe von einem 3D-Drucker abgeschaut hat. Der Picker erreicht eine Auflösung von 0,05 Millimeter entlang der drei Raumachsen und muss sich damit nicht vor kommerziellen Kolonien-Pickern verstecken.
Sehr elegant ist die Lösung für den „Picker-Kopf“, der aus einem ferromagnetischen Metallstab besteht, der über eine Kupferspule magnetisiert wird. Eine kleine Stahlkugel wird von dem magnetisierten Stab festgehalten und nur einmal benutzt. Der Roboter taucht den Picker-Arm mit der Stahlkugel voran in die ausgewählte Bakterienkolonie und positioniert ihn anschließend über einer WellPlatte mit Nährmedium. Der Magnet wird abgeschaltet und die Kugel fällt in das Nährmedium. Für die nächste Kolonie holt sich der Picker-Arm einfach eine neue sterile Stahlkugel, wodurch eine aufwändige Sterilisation zwischen den Pick-Vorgängen vermieden wird.
Das System wird über eine StandardMicrocontroller-Platine mit maßgeschneiderter Software gesteuert, die mithilfe spezieller Algorithmen 50.000 bis 100.000 Klone in nur einem Screening-Schritt ortet und analysiert.
Für den Praxistest ihrer Plattform wählten Grießbeck und Co. das rot fluoreszierende Protein mNeptune684 mit einem Emissionsmaximum bei 684 nm. mNeptune684 ist bekannt für seine starke Stokes-Verschiebung - das heißt, der Abstand zwischen absorbierter und emittierter Wellenlänge ist groß. Grießbecks Mitarbeiter fusionierten mNeptune684 zusätzlich mit dem hellgrün fluoreszierenden Protein mTFP1, das als Referenzfluorophor fungierte. Anhand der Referenzfluoreszenz ermittelte die Gruppe Abweichungen in der Proteinexpressions-Stärke verschiedener E. coli-Kolonien nach der Transformation oder auch in verschiedenen Bibliotheken über die Dauer des Experiments.
Die Münchner mutierten das Fusionsprotein mit verschiedenen Verfahren, etwa mithilfe der Kassetten-Mutagenese und der fehleranfälligen PCR (Error-prone PCR). Anschließend analysierten sie mit der Plattform-Software hunderte Platten mit einer Dichte von 500 bis 800 Kolonien, von denen jeweils die am hellsten leuchtenden Kolonien ausgewählt und mit dem Roboter-Arm gepickt wurden.
Während des Evolutionsprozesses behielt die Software den Überblick über jede einzelne Kolonie, ihre relevanten Eigenschaften und Koordinaten. Eine extensive Error-prone-PCR-Mutagenese mit 100.000 Mutanten war am erfolgreichsten und lieferte optimierte Fluoreszenzprotein-Mutanten, die mindestens eine von vier aus der Literatur bereits bekannte Mutationen aufwiesen. Die Interessanteste nannten die Forscher mCarmine, nach dem organischen roten Farbstoff Karmin.
Die Charakterisierung von mCarmine ergab eine leicht ins Blaue verschobene Emissionswellenlänge von 675 nm und eine fast fünffach verbesserte Leuchtkraft. Letztere kommt der Intensität bakterieller Phytochrome nahe und ist genauso hell oder sogar heller als fluoreszierende Proteine mit vergleichbarer Emissionswellenlänge. mCarmine überzeugte außerdem mit weiteren positiven Eigenschaften, etwa einem für Zellassays günstigen pKa-Wert von 5,6. Zudem tendierte es im Gegensatz zum ursprünglichen mNeptune684 nicht dazu, Dimere oder Tetramere auszubilden.
Die Emission im tiefroten Spektrum prädestiniert mCarmine für die Bildgebung in tieferen Gewebeschichten, da hier die Eindringtiefe und die Streueigenschaften von rotem Licht gegenüber blauverschobenem Licht besser ist. Grießbecks Team demonstrierte dies live, indem sie mit einem mTFP1-mCarmineFusionsprotein Nervenzellen in einer Zebrafischlarve markierten. Bildaufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop lieferten bis in 300 µm Schichttiefe in der Dorso-Ventral-Achse weitaus bessere Bilder im mCarmine-Kanal als im blauen mTFP1-Kanal.
mCarmine ist auch als molekulare Fluoreszenzsonde interessant. Die Gruppe erzeugte verschiedene Fusionen mit subzellulären Zielmotiven und konnte die gewünschten Zielstrukturen in HeLa-Zellen sichtbar machen: Mitochondrien, alpha-Tubulin, Peroxisomen, Aktinfilamente, ER, Nukleus oder Histon 2B.
Die automatisierte Fluoreszenz-Screening-Plattform des Münchener Teams integriert Bildbearbeitung und Online-Datenanalyse sowie Selektion von Kolonien mit gewünschten Eigenschaften in einem Instrument. Ein großer Vorteil ist ihre Flexibilität. Sie eignet sich im Prinzip für jedes Klonierungs-Projekt, das mithilfe fluoreszierender Proteine analysiert werden kann – etwa um Biosensoren, lichtschaltbare Proteine oder die Photostabilität von Proteinen zu optimieren. Die Plattform ist zwar nicht gerade klein, aufgrund des automatisierten Prozesses muss der Experimentator aber kaum eingreifen und spart enorm viel Zeit. Auch preislich ist der Kolonien-Picker sehr interessant, da er mit überschaubaren Kosten selbst konstruiert werden kann und somit für die meisten Labore erschwinglich sein sollte.