(01.09.2020) Isothermale Amplifikationsverfahren machen RT-qPCR-basierten Methoden bei SARS-CoV-2-Tests zunehmend Konkurrenz. In Kombination mit Next Generation Sequencing wären mit ihnen sogar Massentests möglich.
Die meisten der dreihundert kommerziellen Nachweissysteme zur direkten Detektion von SARS-CoV-2 bestätigen COVID-19-Fälle auf ähnliche Weise (finddx.org/covid-19/pipeline/): Die virale RNA wird aus respiratorischen Proben extrahiert, die entweder aus den oberen Atemwegen als Rachenabstrich oder aus den unteren Atemwegen als Luftröhrenspülung, Sputum oder Trachealsekret entnommen wurden. Anschließend wird die konservierte Region des viralen RNA-Genoms mittels reverse Transkriptase (RT)-quantitativer (q) Echtzeit-PCR (RT-qPCR) detektiert.
Das Detektionslimit dieser Tests liegt zwischen zwei bis dreißig Sequenzkopien pro Mikroliter PCR-Reaktion (J. Clin. Virol. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104433). Entsprechend gelingt der SARS-CoV-2-Nachweis mit der RT-qPCR etwa drei Tage vor und bis zu einem Monat nach Beginn der ersten COVID-19-Symptome. Als Zielsequenzen dienen die codierenden Gene für die Proteine Spike (S), Nukleokapsid (N), Envelope (E) und RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) sowie der offene Leserahmen ORF1a/b von SARS-CoV-2. Für den Nachweis sollten wenigstens zwei Genomsequenzen von Coronaviren gefunden werden, von denen mindestens eine spezifisch für SARS-CoV-2 ist. Ähnliche Nachweissysteme, zum Beispiel für Influenzaviren, existieren im klinischen Alltag seit Jahren.
Bis Mitte Juli 2020 wurden weltweit über 280 Millionen SARS-CoV-2-Verdachtsfälle mit der RT-qPCR getestet. Die meisten der hierzu nötigen Arbeitsschritte mussten von geschulten Fachkräften durchgeführt werden, die hunderttausende Proben auswerteten. RT-qPCR-Reagenzien und qPCR-Thermocycler erreichten schnell ihre Kapazitätsgrenzen. Es zeigte sich, dass weder die Kosten, die das Bundesgesundheitsministerium auf 39,40 Euro pro qPCR-Test taxiert, noch ihr Zeitaufwand auf pandemische Größenordnungen hochskalierbar sind. Herkömmliche Nachweissysteme realisieren nur einen Bruchteil der in Zeiten von SARS-CoV-2 notwendigen Amplifikations- und Sequenzierkapazitäten.
Um die Komplexität der RT-qPCR zu umgehen, kombinierten die Zellbiologen um Christian Kaltschmidt an der Universität Bielefeld einen sogenannten Nextgen-Thermocycler mit einer Fluoreszenz-basierten Endpunkt-Messung SARS-CoV-2-spezifischer PCR-Produkte. Der Nextgen-Thermocycler erhitzt PCR-Ansätze auf einer Polypropylen-Folie zwischen Alublöcken, ist also extrem schnell im Vergleich zu klassischen Peltier-basierten PCR-Maschinen. Den Nachweis der E- und N-Gene von SARS-CoV-2 in Rachenabstrichen erledigen die Bielefelder mit ihrer Technik innerhalb von dreißig Minuten (MedRxiv. doi: 10.1101/2020.06.25.20137398v1).
Noch schneller ist der mikrofluidische Extreme Cycler von Carl Wittwer, Erfinder des LightCyclers und inzwischen Professor Emeritus an der University of Utah: Der PCR-Zyklus einer kurzen Sequenz unter hundert Nukleotiden dauert nur noch weniger als eine Sekunde (Biomol Detect Quantif. doi: 10.1016/j.bdq.2019.100081). Geschwindigkeits-limitierend sind nicht länger die Heiz- und Kühlraten der PCR-Geräte, sondern die Extensionsraten der DNA-Polymerasen. Für den schnellen SARS-CoV-2-Nachweis ist solch ein Mikrofluidik-System natürlich wie geschaffen.
Das wissen Wittwers ehemalige Mitarbeiter wie etwa Jared S. Farrar an der Virginia Commonwealth University am besten und kombinieren die Extreme-PCR mit einer optimierten RNA-Extraktion. Von Abstrich bis zum Ergebnis dauert ihr SARS-CoV-2-Test angeblich nur dreieinhalb Minuten. Noch können sich Routinelabore aber nicht selbst davon überzeugen, da eine Publikation sowie die behördliche Zulassung bisher ausstehen.
Die größte Konkurrenz der RT-qPCR im SARS-CoV-2-Nachweis-Wettrennen sind Spielarten der Schleifen-vermittelten isothermalen Amplifikation (LAMP). Das Herzstück von LAMP bildet die DNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen φ29 oder die in silico konstruierten Homologen der Bacillus stearothermophilus-DNA-Polymerase. Dank der strangversetzenden Aktivität dieser Polymerasen entfallen bei LAMP jegliche Heiz- und Kühlschritte. Dadurch ist sie schneller als die qPCR und liefert Ergebnisse binnen Minuten. Darüber hinaus kommt LAMP ohne teure PCR-Cycler aus – die Technik funktioniert isothermal selbst in einfachen Heizgeräten, etwa einem Küchenofen.
Etliche kolorimetrische RT-LAMP-Verfahren werden zur SARS-CoV-2-Diagnose bereits an Patienten getestet. Das HomeDip-RT-LAMP-Protokoll von Max Kellner, Andrea Pauli und Julius Brennecke vom Wiener BioCenter beispielsweise erlaubt einen Virusnachweis aus Nasenhöhlen-Abstrichen oder Gurgelproben binnen Minuten selbst in den eigenen vier Wänden und ohne jegliche Laborausstattung (siehe auch siehe auch LJ online www.laborjournal.de/editorials/2039.php). Da das Wiener Verfahren virale RNA auf einem Zellulosestreifen nachweist, ist die Skalierung jedoch eine Herausforderung (BioRxiv doi: 10.1101/2020.06.23.166397).
Egal welches Detektionsformat letztendlich zum Einsatz kommt, gegenwärtige Pandemiestrategien vertrauen der Testung von COVID-19-Verdachtsfällen. Von einer Untersuchung asymptomatischer Personen rät das Robert-Koch-Institut ab, da bei negativem PCR-Nachweis eine Infektion mit SARS-CoV-2 nicht ausgeschlossen werden kann. Selbst mit allen verfügbaren Nachweis-Kits wäre es zudem kaum möglich, die Ausbreitung von SARS-CoV-2 in der Bevölkerung unabhängig von Covid-19-Symptomen nachzuverfolgen.
Eine relativ einfache Möglichkeit, die Probenkapazität zu erhöhen und Tests zu beschleunigen, sind Sammelproben (Pooling-Verfahren). Am 18. Juli 2020 segnete die US-amerikanische Arzneimittelbehörde (FDA) erstmals einen diagnostischen SARS-CoV-2-Test von Sammelproben ab. Auf den ersten Blick sieht das neue Testverfahren, das der US-amerikanische Diagnostik-Riese Quest Diagnostics einsetzt, nur nach Arbeitserleichterung aus. Doch es öffnet die Tür zur zeitgleichen Testung ganzer Bevölkerungsgruppen. Vor allem aber ermöglicht es, die SARS-CoV-2-Pandemie ohne Vakzine zu überwinden.
Was ist also der Vorteil von Quest Diagnostics‘ Teststrategie? Ihr SARS-CoV-2-RT-qPCR-Test darf Abstriche von bis zu vier Personen im selben Röhrchen analysieren. Dieser Sammelansatz punktet in Gegenden geringer Durchseuchung, in denen ein positives Testergebnis nur selten die getrennte Analyse der vier Proben erfordert. So spart der Assay Dreiviertel an Chemikalien, Personal und Zeit ein. In Zeiten einer Ressourcenverknappung ist das ein entscheidender Vorteil, der auf die meisten Testformate übertragen werden kann.
Bereits im März 2020 wiesen Nasa Sinnott-Armstrong (Stanford University), Daniel L. Klein (Oracle Corporation) und Brendan Hickey (Google Inc.) auf das Potenzial von Gruppentests zur Bekämpfung von SARS-CoV-2 hin (Medrxiv. doi: 10.1101/2020.03.27.20043968v1). Abhängig von der Virus-Verbreitung und der Skalierung von Einzeltests auf 4-, 96- oder 384-Well-Mikroplatten reduzieren Sammelproben die Anzahl notwendiger Tests auf bis zu ein Achtel. Ein interaktives Web-Tool zu ihrer Pooling-Strategie (technopolymath.shinyapps.io/pooled_covid_testing/) verdeutlicht eines ganz klar: Skalierbarkeit ist das Alpha und Omega Pandemie-tauglicher Diagnostikverfahren.
Auch verschiedene deutsche Gruppen und Diagnostiklabore experimentieren mit Sammelproben (siehe hierzu auch Laborjournal 5/2020, Seite 62 - Link). Jüngstes Beispiel ist die Leipziger Arbeitsgruppe von Svante Pääbo, dem Begründer der Paläogenetik: Über mehrere Wochen testeten die Wahl-Leipziger täglich die Mundspülungen von zweihundert Bewohnern und Mitarbeitern eines Pflegeheims auf Coronaviren. Selbst in Ein-Mikroliter-Aliquots von Zehn-Milliliter-Gurgelproben konnten sie SARS-CoV-2 mittels RT-qPCR detektieren. Der Nachweis gelang ihnen ebenfalls in Sammelproben von bis zu 26 Personen (MedRxiv. doi: 10.1101/2020.06.24.20139501v1).
Pääbos Protokoll bietet eine Reihe von Vorteilen: Im Hochdurchsatz-Screening kostet der Test unter vier Euro pro Probe. Gurgelproben können ohne medizinisches Fachpersonal bereitgestellt werden. Knapp fünfzig Institutionen in der Größenordnung des oben erwähnten Pflegeheims können auf einer 96-Well-Mikrotiterplate in neunzig Minuten für dreihundert Euro getestet werden. Inklusive Transport und Evaluierung vergehen weniger als fünf Stunden, bis die Resultate am Ort der Probenentnahme zur Verfügung stehen.
Eine periodische Testung weiter Kreise der Bevölkerung scheint also machbar. Hans Lehrach, emeritierter Direktor des Berliner MPI für molekulare Genetik und einer der Pioniere in der Entwicklung von Genomanalyse-Techniken, geht noch weiter: „Die populationsweite Testung und Quarantäne Infizierter und eventueller Testverweigerer könnte es uns ermöglichen, SARS-CoV-2 in kurzer Zeit zu eliminieren, und zwar für einen vergleichsweise trivialen Betrag im Vergleich zu den medizinischen und wirtschaftlichen Verlusten durch die SARS-CoV-2-Pandemie. Die Entwicklung eines Impfstoffs, die nicht notwendigerweise Erfolg haben muss, wird mit unglaublichem finanziellen Einsatz weltweit verfolgt. Die weniger riskante Möglichkeit populationsweiter Tests wird von den politischen Entscheidungsträgern weitestgehend ignoriert. Bisher hat sich die Bundesregierung nicht für diese Möglichkeit interessiert.“
Deshalb erarbeitet Lehrach in Kooperation mit George Church, dem Initiator des Personal Genome Project und Direktor am NIH Center for Excellence in Genomic Science, wie Amplifikations- und Sequenzierungs-Techniken zusammen mit Kontaktverfolgungsansätzen vor zukünftigen Pandemien schützen können. Ihr Ziel ist es, landesweite Infrastrukturen zu errichten, mit denen Bevölkerungsgruppen unabhängig von ihrem Symptom- und Kontaktstatus regelmäßig auf Pathogene wie SARS-CoV-2 getestet werden könnten. Denn nur ein Mangel an Wirten kann pathogene Viren und Bakterien ausrotten. Wie diese Mammutaufgabe zu bewältigen ist, beschreiben sie in ihrem White Paper: alacris.de/wp-content/uploads/2020/05/Der-Ausweg-aus-der-Pandemie.pdf.
Möglich wäre der Test ganzer Bevölkerungsgruppen mit dem von Jonathan L. Schmid-Burgk in Feng Zhangs Team am Broad Institute of MIT and Harvard entwickelten LAMP-Seq-Verfahren, das die isothermale Amplifikation mit der Short-read-Next-Generation-Sequenzierung kombiniert (siehe hierzu auch das Interview mit Schmid-Burgk auf der nächsten Seite). LAMP-Seq erweitert die RT-LAMP-Reaktion von Abstrichproben mit SARS-CoV-2-spezifischen Primern um individuelle Nukleotidsequenzen, die als Barcodes dienen. Die markierten Proben werden vereinigt und können ressourcenschonend mittels PCR amplifiziert und danach sequenziert werden. Verwechslungen von Proben im gemeinsamen PCR-Gefäß aufgrund von Sequenzierfehlern verhindern speziell designte Barcode-Sequenzen. Mit einem 75 Zyklen umfassenden Sequenzierlauf können laut Schmid-Burgk, der seit Juni 2020 eine Arbeitsgruppe am Bonner Institut für Klinische Chemie und Pharmakologie leitet, an einem halben Tag bis zu 100.000 Proben getestet werden (BioRxiv doi: 10.1101/2020.04.06.025635v2).
Einen ähnlichen Ansatz verfolgt auch der englische Hersteller von Nanoporen-Sequenzierern Oxford Nanopore. Das LamPORE-Verfahren der Engländer kombiniert LAMP mit der Nanoporen-Sequenzierung (nanoporetech.com/covid-19/lampore). Nach Angaben der Firma können mit LamPORE in vier Stunden bis zu 1.152 Proben auf der portablen MinION-Durchflusszelle sequenziert werden. Oxford Nanopores Benchtop-Sequenziermaschine GridION schafft in der gleichen Zeit sogar 5.760 Proben. Noch ist LamPORE aber nicht behördlich zugelassen.