Lichtscheiben-Mikroskope liefern spektakuläre Bilder. Diese Aufnahme zeigt das Nervensystem eines sieben Tage alten Hühnerembryos. Foto: mesoSPIM
(12.10.2020) 2014 war die Lichtscheiben-Mikroskopie für die Editoren von Nature Methods die Methode des Jahres. Was gibt es Neues und wohin geht die Reise?
Schlagende Herzen oder die Bewegung von Leukozyten in vivo aufnehmen, Gehirnaktivität darstellen, Pflanzenwurzeln beim Wachsen oder die Entwicklung eines tierischen Embryos live beobachten, nur einzelne Zellen oder gar einzelne Moleküle anschauen – das alles und viel mehr kann man mit einem Lichtscheiben-Mikroskop (LSM) bewerkstelligen. Denn es ist erstens sehr schnell und kommt zweitens mit wenig Laserlicht aus, schont also die Proben und die Fluorophore – die meisten Anwender machen schließlich Lichtscheiben-Fluoreszenz-Mikroskopie. Damit kann man insbesondere in der Zell- und Entwicklungsbiologie vielen biologischen Fragen nachgehen, die man mit anderen Methoden nicht untersuchen kann.
Die Lichtscheiben- oder auch Lichtblatt-Mikroskopie fand ihren Durchbruch mit dem bahnbrechenden Science-Paper von Jan Huisken und Kollegen der Arbeitsgruppe Ernst Stelzer aus dem Jahr 2004. Sie stellten diese Technologie darin als Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) vor (Science 305: 1007-09). Zehn Jahre später war die Lichtscheiben-Mikroskopie in der Biologie zwar etabliert, aber noch weit davon entfernt, Alltagsmikroskopie zu sein. Es gebe keinen Zweifel daran, dass Biologen Unterstützung durch Technologieentwickler benötigten, um die Lichtscheiben-Mikroskopie in ihrem vollen Umfang nutzen zu können, konstatierten 2015 Huisken und Co-Autoren in ihrem Übersichtsartikel „Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists“ (Nat. Methods 12: 30-4).
Inzwischen sind weitere fünf Jahre vergangen. Haben die Gerätedesigner ordentlich gearbeitet und die Lichtscheiben-Mikroskope benutzerfreundlicher gemacht? Soll man sich eines kaufen, und wenn ja, welches? Oder ist man doch lieber sparsam und baut sich ein eigenes? Wie viel Abenteuer muss man dafür aushalten können? Liefern Lichtscheiben-Mikroskope jetzt schärfere Bilder, haben sie eine höhere Auflösung? Wenn ja, wie wurde das erreicht? Diesen Fragen gehen wir hier nach.
Lichtscheiben-Mikroskopie (LSM) ist eine ideale Technik, um durchsichtige und geklärte Proben abzubilden. Aktuell haben etliche Firmen Geräte mit unterschiedlichen optischen Designs auf dem Markt. „Bevor man sich für ein Gerät entscheidet, muss man sich darüber klar werden, welche Art von Probe man damit untersuchen will und wer mit dem Gerät arbeiten wird“, betont LSM-Experte Fabian Voigt vom Brain Research Institute der Universität Zürich.
Steht das LSM in einer zentralen Service-Abteilung und wird vom Power-User bedient? Arbeitet daran ein unerfahrener Doktorand oder ein erfahrener Postdoc, mit dessen Jobwechsel auch das Wissen um die Bedienung des Mikroskops verloren geht? Ist ein LSM doch nur was für Technologie-affine Biologen?
Und was ist mit der Probe: Ist sie dick oder dünn, groß oder klein, fixiert oder lebend? Will man ein ganzes Organ anschauen oder mehr ins Detail gehen, subzelluläre Strukturen oder sogar einzelne Moleküle untersuchen? Das muss man wissen, denn am Lichtscheiben-Mikroskop kann man nicht mal schnell durch Wechsel des Objektivs und per Drehen am Objektivrevolver vom Großen ins Kleine zoomen.
Dass man die Objektive nicht einfach wechseln kann, liegt am Aufbau des Instruments. Die ursprüngliche und auch heute noch verkaufte Version hat zwei oder mehr Objektive: Ein oder zwei Objektive erzeugen die Lichtscheibe, das dritte, welches das Bild generiert, steht senkrecht zur Lichtscheibe und den anderen Objektiven. Da jedes Objektiv ein gewisses räumliches Ausmaß hat, ist es einleuchtend, dass man sie nicht beliebig eng zueinander anordnen kann. Aufgrund des vergleichsweise großen Arbeitsabstands muss man Objektive mit kleiner numerischer Apertur (NA) verwenden.
Die NA beschreibt die Lichtstärke und das Auflösungsvermögen des Objektivs. Bei kleiner NA bleibt die Auflösung des Mikroskops vergleichsweise gering. Damit kann man Gewebe abbilden, aber für einzelne Zellen reicht es kaum. „Das war und ist eine der echten Limitierungen der klassischen Lichtscheiben-Mikroskopie“, sagt Anita Jannasch, Physikerin am Zentrum für Pflanzenmolekularbiologie der Universität Tübingen.
Die Auflösung eines LSM hängt nicht nur von der NA des Detektionsobjektivs ab, sondern auch von der Dicke der Lichtscheibe. Diese ist zwar planar, aber nie überall gleich dick und hat eine bikonkave Form. An der schmalsten Stelle, die man Strahltaille (beam waist) nennt, wird detektiert.
Sehr dünne Lichtscheiben zu erzeugen, ist nicht trivial. Eric Betzig und seine Kollegen am Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Institute fanden mit dem Lattice Light Sheet Microscope (LLSM) eine Lösung für dieses Problem. Sie verwendeten Bessel-Strahlen zur Beleuchtung und kombinierten sie mit der hochauflösenden Strukturierten Illuminationsmikroskopie (SIM). SIM ist eine schon länger bekannte Technologie, mit der man Auflösungen um die 200 Nanometer in der x/y-Ebene erreichen kann. Der Bessel-Strahl hat zwei wesentliche Vorteile: Er ist zum einen in seinem Zentrum schmaler als der sonst verwendete Gauß-Strahl. Zum zweiten kann er sich nach einer Störung durch ein Objekt in „dessen Schatten“ durch Interferenz selbst „heilen“ und hat eine größere Fokustiefe.
Alles in allem erreicht man damit eine höhere Auflösung oder kann mit geringerer Lichtintensität arbeiten. Die Leistungsfähigkeit ihres LLSM mit Lichtscheiben von erstmals weniger als einem Mikrometer dokumentierten Betzig et al. in einem phantastischen Paper an zwanzig biologischen Proben (Science 346: 1257998). „Das war super, jeder wollte dann ein Lattice-Light-Sheet-Mikroskop haben“, erinnert sich Markus Sauer von der Universität Würzburg, Spezialist für höchstauflösende Mikroskopie. Es war zwar ein Jahr Arbeit, aber dann hatte er auch eines.
Beim reflektierenden Lichtscheiben-Mikroskop wird der Licht-Vorhang durch einen Spiegel um 90 Grad umgelenkt, wodurch er parallel zur Bildebene verläuft. Anita Jannaschs Gruppe entwickelte das Gerät weiter, um schnelle dreidimensionale Aufnahmen der Proben zu erhalten Illustration: Universität Ulm
Auch Jannasch und ihre Kollegen brauchen dünne Lichtscheiben, denn sie wollen Moleküle in einzelnen Zellen dreidimensional anschauen. Dafür benötigen sie außerdem Objektive mit geringem Arbeitsabstand und hoher NA. Gewöhnliche Lichtscheiben-Mikroskope eignen sich dafür nicht. Also entwickelten sie ein reflektierendes LSM weiter (bioRxiv, doi: 10.1101/2020.06.26.174102).
Die Idee für dessen Aufbau kam ursprünglich von Christof Gebhardt, der heute an der Universität Ulm forscht. Er baute im Labor von Sunney Xie an der Harvard University ein Reflected Lightsheet Microscope (RFLM), und mikroskopierte damit Einzelmoleküle (Nat. Methods 10: 421-6). Der Clou an dem Gerät ist, dass die Lichtscheibe zwar durch ein Objektiv erzeugt wird, das senkrecht zur Probenoberfläche steht, danach aber über einen beweglichen Spiegel oder einen AFM-Cantilever um 90 Grad gespiegelt wird, so ass die Lichtscheibe horizontal durch die Probe läuft. Durch die Verschiebung des Spiegels/Cantilevers kann man sie entlang der z-Achse durch die Probe bewegen. Unter der Probe befindet sich das Objektiv zur Detektion, ähnlich wie in einem invertierten Mikroskop. Da sich die beiden Objektive sterisch nicht behindern, kann man Typen mit großer NA bei geringem Arbeitsabstand verwenden und erhält Bilder mit hoher Auflösung.
Jannasch: „Wir arbeiten bei unserem Gerät mit einer NA von 0,8 und erreichen eine Lichtblattlänge von zehn Mikrometern bei einer Höhe von weniger als einem Mikrometer.“ Um dreidimensionale Bilder zu generieren, bewegt Jannasch die Lichtscheibe mittels eines Piezo-getriebenen, sehr schnell verkippbaren Spiegels. Die Fokusebene des Detektionsobjektivs ändert sie nicht, indem sie den Objekttisch rauf und runter bewegt – das könnte die Probe beeinflussen. Sie nutzt dafür verstellbare Linsen. „Die Frage war nun: Wie schnell sind wir damit eigentlich?“, sagt Jannasch. Antwort: „Auf jeden Fall schneller als die konfokale Mikroskopie und auch schneller als die Lichtscheiben-Mikroskopie mit Bessel-Beam. Wir sind so schnell, dass wir die Diffusion einzelner Moleküle detektieren können, obwohl wir von der optischen Auflösung her kein High-Resolution-Gerät haben.“
Als Proof-of-Principle machten die Forscher Aufnahmen künstlicher Vesikel, bei denen sie die Diffusion von Lipiden in 3D sehen konnten. Jannasch: „Wir wollen das Gerät zur Beobachtung von Pflanzenzellen benutzen. Die haben leider eine sehr hohe Autofluoreszenz, sodass man selbst mit konfokaler Mikroskopie oft nicht weit kommt. Bei der Lichtscheiben-Mikroskopie wird die Probe von der Seite mit einer fokussierten Lichtscheibe angeregt, während das Fluoreszenzlicht senkrecht zur Beleuchtungsebene detektiert wird. Daher ist die Autofluoreszenz-Anregung außerhalb der Bildebene minimiert. Deshalb eignet sich diese Methode für unser Vorhaben viel besser.“
Ein anderer Aufbau, der dünne Lichtscheiben erzeugt, sowie sehr schnell und obendrein benutzerfreundlich ist, basiert auf dem Konzept des Remote Focusing Microscope. Diese Methode wurde von Edward Botcherby und Kollegen an der Universität Oxford (UK) entwickelt (Optics Comm. 281: 880-7). Das in der fokalen Ebene des ersten Objektivs erzeugte Bild wird über Linsen in ein zweites Objektiv hineinprojiziert. Dabei werden die vom ersten Objektiv erzeugten sphärischen Abbildungsfehler wieder „gelöscht“. Diese sehr benutzerfreundliche Technologie, die sich besonders für konfokale Mikroskopie und Multiphotonen-Mikroskopie eignet, erlaubt sehr schnelles Scannen, da weder die Probe noch das erste Objektiv bewegt werden müssen.
Den Aufbau verwendeten zunächst Chris Dunsby vom Imperial College in London für die Lichtscheiben-Mikroskopie (Opt. Express 16, 20306-16). Anschließend entwickelte ein Team um Andrew York und Alfred Millett-Sikking (Calico Life Sciences, San Francisco) gemeinsam mit der Gruppe von Reto Fiolka (University of Texas Southwestern, Dallas) das Gerät weiter. Dunsby taufte die Technologie Oblique Plane Microscopy. Die Amerikaner nannten ihre Version Single Objective Lightsheet Microscopy – obwohl man drei Objektive braucht. Das ist ein bisschen verwirrend. „Stimmt“, gibt Fiolka zu. „Die Zahl ,eins‘ bezieht sich auf das Objektiv, das der Probe am nächsten ist. Dieses wird nämlich sowohl für die Beleuchtung wie auch die Detektion des Signals verwendet.“
Das ist ein großer Vorteil dieses Instruments, denn zur Detektion kann man ein Wasser- oder Öl-Immersionsobjektiv mit hoher NA und sehr kleinem Arbeitsabstand verwenden. Außerdem kann man seine Probe auf einem gewöhnlichen Objektträger oder in einer Multiwellplatte platzieren, wie bei einem ganz normalen Lichtmikroskop. Komplizierte Probenmontierungen, wie man sie von Lichtscheiben-Mikroskopen mit „klassischem“ Design kennt, sind nicht nötig. Die Lichtscheibe ist so dünn, dass sie nur einen kleinen Bereich der Objektivlinse benötigt und unter einem flachen Winkel die Probe beleuchtet. Mit einem beweglichen Spiegel wird sie durch das Objektiv gelenkt und damit über die Probe gescannt. Das Signal wird mit einer verkippten Fokalebene abgebildet – und zwar jeweils durch einen Teil der Linse, den die Lichtscheibe gerade nicht beleuchtet. So kommen sich die beiden Strahlen nicht ins Gehege.
Das sekundäre Objektiv ist ein Luftobjektiv. Das dritte Objektiv ist etwas Besonderes: Es ist verkippt zum zweiten Objektiv angeordnet, so dass seine Fokalebene wieder parallel zur Lichtscheibe verläuft. Es kann besonders viel Licht einfangen, selbst extrem schräge Strahlen. Verantwortlich hierfür ist ein auf die Objektivlinse aufgeklebtes Stück Glas, das an einer Seite teilweise schräg abgeschnitten ist und an ein Prisma erinnert.
Fiolka schmunzelt: „Wegen gewisser Ähnlichkeit wurde das Objektiv ,Mister Snouty‘ getauft. Auf deutsch wäre das Herr Schnauze oder Herr Schnute. Klingt übersetzt etwas doof, vielleicht müssen wir uns da etwas anderes überlegen. Aber der Name ist uns im Englischen ans Herz gewachsen.“ Das Design arbeitet mit über 420 Millionen Voxel pro Sekunde extrem schnell – tatsächlich bestimmt die Kamera die Geschwindigkeit. Es ist daher für drei- und vierdimensionale Mikroskopie bestens geeignet. Die Auflösung leidet nicht unter der Geschwindigkeit: Sie wird nur durch die Physik begrenzt und erreicht weniger als 300 Nanometer bei Verwendung von grüner Fluoreszenz (bioRxiv doi 10.1101/2020.04.07.030569).
Die Entwickler sind von ihrem Design außerordentlich überzeugt. Sie glauben, dass ihr Gerät mit der Scanning-Option für zellbiologische Untersuchungen die viel verwendeten Laser Scanning- und Spinning-Disk-Konfokalmikroskope ergänzen oder gar ersetzen kann – sowohl in einzelnen Laboren wie auch in Mikroskopiezentren. Wie das Gerät funktioniert, ist auf der Webseite von Andrew York ausführlich erklärt (https://andrewgyork.github.io/high_na_single_objective_lightsheet).
Ein unter Mikroskopikern bekannter Trend, nämlich die Verknüpfung verschiedener analytischer Technologien, hat seit kurzem auch die Lichtscheiben-Mikroskopie erreicht. Korrelative oder multimodale Mikroskopie heißt es im Fachjargon. Hier sind zwei Beispiele.
Markus Sauer und sein Team kombinieren Lichtscheiben-Mikroskopie und Nanoskopie. „Lokalisationsmikroskopie liefert ein Bild davon, wo sich einzelne Moleküle befinden und wie sie sich verhalten. Allerdings sieht man dabei nur die Moleküle an der unteren Oberfläche einer Probe“, erklärt Sauer. Jahrelang habe er sich daher gefragt, ob die beobachtete Clusterbildung bestimmter Rezeptoren ein Effekt auf den Kontakt mit dem Glas des Objektträgers ist oder tatsächlich in vivo stattfindet. Um einzelne Rezeptoren an lateralen Membranen, beispielsweise zwischen zwei Zellen, zu beobachten, verwendet man im Sauer-Labor ein Lattice-Light-Sheet-Mikroskop – original nach dem Betzig-Aufbau – sowie die Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM).
Die Lichtscheiben-Technologie bietet hier den Vorteil, dass nur die Fluorophore bestrahlt werden, die gerade lokalisiert werden, wodurch das Photobleichen der Fluorophore minimiert wird. Über das Ergebnis der Analysen freut Sauer sich sehr: „Was viele befürchtet hatten, dass wir nämlich bisher ein Artefakt beobachteten, ist nicht eingetreten, das heißt, der Kontakt zur Glasoberfläche induziert kein Clustering, es werden aber auf der dem Glas zugewandten Seite weniger Rezeptoren detektiert. Zusätzlich fanden wir eine Akkumulation von CD56-Rezeptoren an Zell-Zell-Kontaktflächen (Nature Comm. 11: 887).“ Diese korrelative 3D-LLS-dSTORM sei eine „einzigartige“ und „robuste“ Methode, um Rezeptoren in der Plasmamembran bei Zell-Zell-Interaktionen zu studieren, meinen die Forscher.
In völlig anderer Kombination praktiziert man Lichtscheiben-Mikroskopie in Süddeutschland: Am Helmholtz-Zentrum München verbinden sich LFSM und bildgebende Massenspektrometrie zu einem multimodalen Imaging (Sci. Rep. 10: 14461). Während die zerstörungsfreie Mikroskopie die morphologischen Strukturen einer gefärbten, markierten oder auch nur geklärten Probe abbildet, liefert die anschließende bildgebende Massenspektrometrie die Information darüber, welche Moleküle räumlich wo lokalisiert sind.
Senior-Autor Axel Walch sieht einen großen Vorteil: „Die Stärke dieses Verfahrens ist, dass der Nachweis weder auf eine Markierung noch auf eine Klasse von Molekülen festgelegt ist. Wir können außer Proteinen und Lipiden auch kleine Moleküle wie therapeutische Wirkstoffe oder endogene Steroide in ihrem dreidimensionalen Zusammenhang auf Organebene verstehen.“
Die Technologie werde weiterentwickelt, um im hohen Durchsatz viele Proben schnell zu messen und somit beispielsweise für Analysen von Wirkstoffen und metabolischen Veränderungen zu verwenden, fügt Co-Autorin Annette Feuchtinger hinzu. Ebenfalls Autor der Proof-of-Principle-Studie ist Achim Buck. Er wird das Verfahren bei der Firma Theratype, einer Ausgründung der Helmholtz-Gemeinschaft und des Zentrums, zukünftig anwenden und weiterentwickeln.
Inzwischen bieten viele Firmen Lichtscheiben-Mikroskope in unterschiedlichen Designs an. Darunter Lattice-Light-Sheet-Varianten für hochauflösende Aufnahmen sowie Geräte mit geringer Vergrößerung für die Mikroskopie großer fixierter oder lebender Proben. Man kann sich aber auch ein Gerät leihen oder nach öffentlich zugänglichen Beschreibungen eines selber bauen.
Die Variante „leihen“ bietet Jan Huisken vom Morgridge Institute for Research in Madison (USA) an. Er setzte mit seinem Team die Idee vom „Mikroskop auf Reisen“ um. „Flamingo“ heißt das kleine, mobile und modulare Gerät, das man sich bei Huisken für seine Experimente borgen kann – ohne es kaufen zu müssen. Man könne es in einem Koffer verstauen, wirbt Huisken, und das sei sinnvoll, denn ein Mikroskop könne leichter verreisen als empfindliche Proben. Er ist überzeugt, dass es der Reproduzierbarkeit der Daten diene, wenn alle Nutzer denselben Geräte-Typ benutzen.
Auch Fabian Voigt hat in Zürich ein Lichtscheiben-Mikroskop entwickelt, das man nachbauen kann: das mesoSPIM. Die Bauanleitungen für die Hardware und die nötige Software sind frei zugänglich (Nat. Methods 16: 1105-8). Zwölf Arbeitsgruppen haben damit bisher ein mesoSPIM zusammengeschraubt. Hinter dem Begriff mesoSPIM verbirgt sich ein LSM, das für große Proben geeignet ist. Das Sehfeld (Field of View) ist etwa einen Quadratzentimeter groß. „Damit lässt sich beispielsweise ein Mausgehirn in einem Bild vollständig darstellen. Dank unserer technischen Ausstattung gelingt dies innerhalb von weniger als zehn Minuten mit einem vergleichsweise kleinen, nämlich 12 bis 16 Gigabyte umfassenden Datensatz“, berichtet Voigt. Mit dem Gerät könne man innerhalb weniger Minuten 3D-Bilder generieren. Es eigne sich auch für einen schnellen Durchsatz, denn die Proben werden mit ihren Haltern magnetisch fixiert. Trotz der Eigenarbeit müsse man 150.000 bis 250.000 Euro auf den Tisch legen, so teuer seien die benötigten Komponenten. „Wir arbeiten gerade an einer 100K-Version“, so Voigt. Seine Idee: Er möchte ein Bench-Top-Gerät mit den Ausmaßen einer mittelgroßen Zentrifuge entwickeln – also ähnlich groß wie das Flamingo.
Auch das Single-Objective-LSM eignet sich für den Zusammenbau in Heimarbeit. „Man muss sich nicht extra ein einige Hunderttausend Euro teures neues Mikroskop kaufen, um Lightsheet-Mikroskopie zu machen, denn man kann diesen Aufbau nachträglich wie ein Modul an jedes Lichtmikroskop anbauen, sofern dort noch ein Port frei ist. Das ist super für den End-User“, ist Fiolka überzeugt.
Diese Initiativen sollen die Lichtscheiben-Mikroskopie in der Biologen-Szene noch mehr verbreiten. Voigt ist in Sachen Eigenbau allerdings vorsichtig. „Ein Einsteiger sollte eher ein kommerzielles Gerät kaufen. Nicht weil es unbedingt so viel besser ist als ein eigenhändig angefertigter Nachbau, sondern weil man damit auch den nötigen Support bekommt. Geräte wie das mesoSPIM selber zu fertigen, ist eher was für erfahrenere Wissenschaftler und Power-User, die von der Vielseitigkeit und Performance eines Eigenbaus profitieren.“
Egal ob gekauft oder selber gebaut: Um mit einem LSM schöne Bilder anzufertigen, muss man sowohl das Präparieren der Proben als auch das Mikroskopieren trainieren. Hat man keine durchsichtige Probe, muss man ein jeweils passendes Klärungs-Verfahren finden und es üben. „Von einer geklärten Probe zu etwas, das man quantifizieren kann, ist es ein großer Schritt“, betont Voigt. Obendrein liegen die Proben bei vielen Designs nicht flach auf einer Schale, sondern „hängen“ senkrecht in einer wie auch immer gearteten Fixierung. Voigt: „Das muss man wirklich üben, weil die Ansicht, die man bekommt, ganz anders ist als gewohnt. Beim Suchen nach der richtigen Stelle kann man schon mal Sachen finden, nach denen man gar nicht gesucht hat.“ Diese Erfahrung machte er selber: Er entdeckte perfekt gelabelte Purkinje-Neuronen im Kleinhirn einer Mauslinie, in der eigentlich ganz andere Zelltypen markiert sein sollten.
Die hier vorgestellten Beispiele sind nur eine Auswahl der Lichtscheiben-Mikroskopie und -Technologien, die in den letzten Jahren gebaut wurden. Die Geräteentwickler sind aber noch längst nicht am Ende. Welche Variante sich durchsetzen wird, ist noch nicht entschieden. Wahrscheinlich werden es verschiedene sein, die man passend zur jeweiligen biologischen Fragestellung einsetzen kann.