Bauteile eines µNMR-Geräts, das Forscher von der University of Macau sowie der Harvard University Anfang des Jahres vorstellten. Herzstücke sind der Halbleiter-Chip mit der Transceiver-Einheit sowie der kleine portable 0,51Tesla Permanentmagnet. Foto: University of Macau
(12.10.2020) In der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) führt scheinbar kein Weg vorbei an quantenmechanischem Expertenwissen, empfindlichen Hochfeld-Magneten und Anschaffungskosten in Millionenhöhe. Dass NMR auch anders geht, beweisen miniaturisierte µNMR-Spektrometer für Zellanalyse und Point-of-Care-Diagnostik.
Einer der µNMR-Pioniere ist der Exildeutsche Ralph Weissleder an der Harvard Medical School in Boston. Seit zwei Jahrzehnten entwickelt seine Arbeitsgruppe Laborprototypen tragbarer NMR-Systeme. Ihr größter Baustein ist ein Permanentmagnet von der Größe einer Kaffeetasse. Im Vergleich zu zimmerhohen und kryogengekühlten Schwergewichten wie den 28,2-Tesla-Forschungsmagneten der ETH Zürich oder des Göttinger MPI für Biophysikalische Chemie erscheint seine Magnetfeldstärke von 0,5 Tesla nichtig.
Die Sensitivität von NMR-Spektrometern hängt aber unter anderem von der Stärke des magnetischen Feldes ab. Was können µNMR-Spektrometer also leisten? Zur Aufklärung von Struktur und Dynamik biologischer Makromoleküle taugen sie jedenfalls nicht. Sie sind eher darauf spezialisiert, Zielstrukturen wie etwa zirkulierende Tumorzellen (CTC) oder Pathogene in Körperflüssigkeiten und Biopsien aufzuspüren – in Echtzeit und nicht-invasiv. Zirkulierende Tumorzellen zu detektieren, ist eine große Herausforderung: In einem Milliliter Vollblut befinden sich neben Millionen Leukozyten und Milliarden Erythrozyten nur eine Handvoll CTCs. Um Infektionen mit Pathogenen zu diagnostizieren, müssen Proben oft über Tage kultiviert und durch einen Experten ausgewertet werden.
Weissleders µNMR-System kann dank der Messung des Relaxationsverhaltens spezifischer Zielmoleküle schon nach einer Stunde eine Diagnose stellen, und zwar mit einer Genauigkeit, die herkömmliche Plattformen zur Zelldetektion wie etwa CellSearch nicht gewährleisten (Neoplasia 14(5): 388-95). Einfachere Zielstrukturen wie zum Beispiel Antikörper gegen Influenzaviren übersieht das µNMR-System selbst in pikomolarer Konzentration nicht (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47(22): 4119-21).
Das Geheimnis dieser sogenannten NMR-Relaxometrie verrät Jens Anders, Leiter des Instituts für Intelligente Sensorik der Universität Stuttgart: „Geringe Konzentrationen von Biomolekülen können mittels spezifisch funktionalisierter Nanopartikel detektiert werden.“ Ein Beispiel hierfür sind monoklonale Antikörper, die über inverse Diels-Alder-Chemie zwischen trans-Cycloocten und einem Tetrazin kovalent gebunden werden. Diese bioorthogonalen Klick-Reaktionen lösen weder toxische Nebenreaktionen in biologischen Proben aus, noch werden sie von Biomolekülen beeinflusst. Mit Geschwindigkeitskonstanten von bis zu 106 M-1 s-1 holen sie zudem fast Enzyme ein. Anders fügt hinzu: „Prinzipiell kann so ein breites Spektrum an Biomolekülen erfasst werden.“
Die Funktionalisierung mit Antikörpern ist natürlich auch das Herzstück anderer Messmethoden. Die Detektionssensoren der NMR-Relaxometrie arbeiten aber noch mit einem zweiten Trick: Die Nanopartikel sind aus magnetisierbarem Material wie zum Beispiel Eisen(II,III)-oxid gefertigt. Wieso ist das ein Vorteil? NMR-Relaxometer messen, ähnlich wie klinische Kernspintomographen, die transversalen (T2) Relaxationszeiten von Protonen. Antikörper-konjugierte Nanopartikel wirken daher gleichzeitig als Näherungssensor und Kontrast-Reagenz. Sie machen das lokale Magnetfeld in der Nähe erkannter Biomarker inhomogener und zerstören dadurch die Kohärenz der T2-Zeiten benachbarter Wasserprotonen. Markierte Zielstrukturen zeigen ein entsprechend schnelleres Abklingen ihres NMR-Signals. Daraus können die Expressionslevel gebundener Zelloberflächenmarker quantifiziert werden. Die eigentliche µNMR-Messung dauert nur Minuten – Probenentnahme und Inkubation mit Antikörper-konjugierten Nanopartikeln sind die zeitaufwendigsten Schritte NMR-relaxometrischer Untersuchungen.
Nur einzelne Biomarker zu detektieren, führt in der Krebsdiagnostik jedoch schnell zu falsch-positiven oder falsch-negativen Aussagen. Deshalb wertet die Quad-µNMR mehrere Tumormarker wie etwa EpCAM, HER2, EGFR und MUC1 simultan aus, wodurch sich entartete Zellen selbst in Vollblut und ohne jegliche Reinigung in 99 Prozent aller Patienten identifizieren lassen. Zur korrekten Diagnosestellung reichen wenige Mikroliter Körperflüssigkeit (Nanomedicine 3: 821-8).
Anders bringt die Messmethodik auf den Punkt: „Sie steht und fällt mit der Verfügbarkeit entsprechend funktionalisierter, magnetischer Nanopartikel.“ Was andeutet, dass mehr als nur entartete Zellen detektiert werden können, nämlich auch virale, bakterielle und mykotische Pathogene. Klinisch nützlich sind insbesondere Analysemethoden, die ein ganzes Spektrum von Krankheitserregern erkennen.
Weissleders Arbeitsgruppe kombinierte deshalb magnetische Nanopartikel mit Oligonukleotid-Sonden gegen bakterielle 16S-rRNA-Abschnitte. Je nach Sondensequenz können gleichzeitig bis zu dreizehn klinisch relevante Bakteriengattungen von Escherichia über Klebsiella bis hin zu Staphylococcus detektiert werden. Dafür reichen schon einige wenige Bakterien in einem zwei Mikroliter-Aliquot und zwei Stunden Zeit. Noch müssen die Bakterien allerdings lysiert und ihre RNA extrahiert werden (Nat. Nanotechnol. 8: 369-75).
Die µNMR-Spektroskopie ist indes nicht auf Oberflächenmarker oder lysierte Zellen beschränkt. Kennzeichen vieler Krebszellen ist der Warburg-Effekt, also die Umstellung des Zellmetabolismus hin zu einer Glykolyse mit anschließender Milchsäuregärung, selbst in Gegenwart von Sauerstoff. Das verleiht zum einen dem Krebsgeschwür einen Proliferationsvorteil. Zum anderen fördert das angesäuerte Mikro-Umfeld des Tumors dessen Metastasierung. Anhand des intrazellulären Laktatgehalts kann somit auf die Entartung von Gewebeproben geschlossen werden.
Die dazu notwendige Analyse dauert auf einer μNMR-Plattform zwei Minuten. Für ihren Machbarkeitsbeweis fütterten Bioingenieure um Kayvan Keshari vom New Yorker Memorial Sloan Kettering Cancer Center Suspensionen von Nierentumor-, Leukämie- und Kontroll-Zelllinien auf einem 3D-gedruckten Mikrofluidik-Chip mit 13C-markiertem Pyruvat. Je zwei Aliquots mit einem Mikroliter Probe transferierten sie in eine 1,05 Tesla-Mikrospule. Schließlich quantifizierten sie die intrazelluläre Verstoffwechslung von 13C-Pyruvat in Echtzeit anhand der NMR-Signalzunahme von 13C-Laktat. Bereits zehntausend Zellen reichten aus, um Tumore anhand ihres metabolischen Charakters zu identifizieren (Sci. Adv. 3: e1700341).
Noch gibt Anders aber zu bedenken: „Aufgrund der eingeschränkten Konzentrationsempfindlichkeit derartiger NMR-Fingerprints lassen sich bisher nur hochkonzentrierte Moleküle detektieren. Relevante Biomoleküle und pharmazeutische Wirkstoffe liegen im menschlichen Körper oft noch zwei bis drei Größenordnungen unterhalb der Detektionsschwelle tragbarer NMR-Geräte. Um deren Konzentrationsempfindlichkeit zu verbessern, beschäftigen wir uns mit der Miniaturisierung der Hyperpolarisations-Hardware. Denn sobald wir den einstelligen mikromolaren Bereich erreichen, eröffnen sich in der personalisierten Medizin viele Möglichkeiten!“
µNMR-relaxometrische Techniken scheinen dagegen bereits reif für den klinischen Alltag zu sein. So bietet T2 Biosystems, ein 2006 von Ralph Weissleder mitgegründetes Bostoner Medizintechnikunternehmen, ein vollautomatisches µNMR-Tischgerät an (t2biosystems.com). Es diagnostiziert Infektionen mit Candida-Pilzen, Borrelien und Sepsis-verursachenden Bakterien. Im August 2020 erhielt es außerdem eine US-Notfallzulassung für einen SARS-CoV-2-Test nasopharyngealer Abstriche.
Die ebenfalls in Boston ansässige Firma Waveguide vermarktet das derzeit kleinste µNMR-Gerät mit nur 1,4 Kilogramm Gewicht bei 30 x 13 x 8 Zentimetern Größe (waveguidecorp.com). Wie auch T2 Biosystems T2Dx kombiniert das batteriebetriebene WaveGuide Formµla ein digitales NMR-Spektrometer auf einem Mikrofluidik-Chip mit 0,5-Tesla-Permanentmagnet und misst das Relaxationsverhalten flüssiger Bioproben in Gegenwart von Antikörper-konjugierten Nanopartikeln. Es kann drahtlos über Smartphone oder Tablet, etwa am Patientenbett, gesteuert werden.
All diese Anwendungsbeispiele ließen sich – so effizient und komfortabel handtellergroße µNMR-Geräte auch sein mögen – ebenso mit den Hochfeld-NMR-Spektroskopen der biomedizinischen Strukturaufklärung bewerkstelligen. Deren Schwachstelle liegt allerdings in ihrer mangelnden Sensitivität im Vergleich zu anderen biophysikalischen Methoden, die von der Magnetfeldstärke, Probentemperatur und Anzahl magnetisierbarer Isotope im Detektionsvolumen abhängt.
„Bis vor zehn Jahren waren miniaturisierte Magnete, die eine für die NMR-Spektroskopie benötigte Feldhomogenität von weniger als eins aus einer Million (ppm) erzielen, die größte Herausforderung“, erinnert sich Anders. Mittlerweile können Tischgerät-taugliche Permanentmagnete mit Feldstärken von bis zu zwei Tesla aus Neodym-Eisen-Bor- und Samarium-Cobalt-Legierungen angefertigt werden.
Den Magnetfeldstärken ihrer großen Brüder hinken sie aber noch immer hinterher. Laut Mazin Jouda, Experte für MRI- und NMR-Mikroelektronik am Karlsruher Institut für Technologie, existiert allerdings kein ingenieurtechnisches Hindernis für tragbare µNMR-Spektrometer mit Feldstärken im zweistelligen Tesla-Bereich (J. Magn. Reson. 306: 112-7). Abgesehen von Magnetfeldstärke und Feldhomogenität beschränkt aber auch ihre Temperaturinstabilität noch die erreichbare NMR-Auflösung und -Sensitivität. Die Permanentmagnete reduzieren zumindest aber schon jetzt die Betriebskosten dramatisch, da sie nicht von flüssigem Helium und Stickstoff abhängen.
Miniaturisierte NMR-Detektorspulen punkten dafür bereits heute mit ihren Vorteilen: Das Signal-Rausch-Verhältnis einer Magnetspule verdoppelt sich, wenn ihr Durchmesser halbiert wird. Gleichzeitig verringert sich die notwendige Anregungsleistung um den Faktor vier. Allein durch eine nur noch 1,4 Millimeter breite Mikrospule erreichten die New Yorker Bioingenieure um Kayvan Keshari eine tausendfach höhere Sensitivität ihres µNMR-Systems (Sci. Adv. 3: e170034). Genauso entscheidend für die Messsensitivität ist der Füllfaktor des Detektionsvolumens, der Mikrospulen nicht nur bei wertvollen Proben wie Gewebebiopsien, Rückenmarkextrakten und schwer synthetisierbaren Biomolekülen einen Vorteil verschafft. Innere Spulendurchmesser von nur noch dreißig Mikrometern sind bereits realisierbar.
Mini-Detektorspulen werden entweder Off-Chip verbaut, also außerhalb der NMR-Steuerelektronik-Mikrochips. Oder NMR-Transceiver-Elektronik und Detektorspule werden On-Chip in einem einzigen Schaltkreis integriert. Die erste Bauweise ermöglicht neben einer besseren spektralen Auflösung, bestimmte Probenbestandteile spezifisch mit homogeneren Radiofrequenzpulsen anzuregen. Waveguides µNMR-Chip ist dafür ein Beispiel. Mit der On-Chip-Konstruktion sind sensitive µNMR-Sensoren für Kleinstvolumina realisierbar, wie etwa der des Schweizer Start-ups Annaida von der Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne (annaida.ch).
In On-Chip-Technologien sieht Anders einen der wichtigsten Fortschritte hin zur Point-of-Care-NMR-Diagnostik: „Mikroelektronisch integrierte NMR-on-a-chip-Transceiver bringen die gesamte NMR-Elektronik auf einem einzelnen Mikrochip unter, der eine Fläche von nur einem Quadratmillimeter hat. Das lässt bereits ultrakompakte und batteriebetriebene NMR-Spektrometer zu. Mit ihren Permanentmagneten erzielen sie zwar nur relativ niedrige Feldstärken und in Folge geringe Konzentrationsempfindlichkeiten. Derzeit ist nur die Detektion von Biomolekülen im Bereich von Hunderten Mikromol pro Liter möglich. Da NMR-on-a-chip-Transceiver neben ihrer Hauptfunktionalität, also dem Anregen und Auslesen des NMR-Signals, aber auch Zusatzfunktionen übernehmen können, wie zum Beispiel Temperaturstabilisierung, periodische Systemkalibration und Hyperpolarisation der Kernspinensembles, sind sie der Schlüssel für zukünftige tragbare NMR-Spektrometer.“
Auch die Steuerkonsolen tonnenschwerer Forschungsmagnete könnten mit NMR-on-a-chip-Ansätzen bereits von der Größe eines Schranks auf Smartphone-Größe geschrumpft werden. Diese Miniaturisierung wäre auch möglich, wenn die Signalverarbeitung auf Softwareseite verwirklicht würde. Die hierfür benötigten sogenannten Software-Defined-Radio(SDR)-Platinen sind bereits für zweihundert Euro pro Stück zu haben. Eine Spektrometerkonsole mit vier Kanälen zur simultanen Messung von beispielsweise 1H-, 13C-, 15N- und 31P-Isotopen würde dann nur noch wenige Tausend Euro kosten.
Ein weiterer Schlüssel zur Miniaturisierung liegt in der Installation von µNMR-Magnetspulen auf mikrofluidischen Plattformen. Denn neben der Detektorsensitivität ist eine weitere Herausforderung, kleinste Volumina überhaupt in einem Detektor positionieren zu können. Die Kanälchen mikrofluidischer NMR-on-a-chip-Systeme können mit PolyJet-3D-Druckern mit einer Genauigkeit von wenigen Kubikmikrometern aus Photopolymeren modelliert werden. Sie können aber auch mit dünnen Lötdrähten aus viskoelastischen Biomaterialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS) herausgeschmolzen oder durch 3D-Laserlithographie mikrometergenau in Quarzglas geschnitten werden.
Das von dem Schweizer Start-up Annaida konstruierte EmbryoSpin-Gerät detektiert Merkmale einzelner Zellen.
Foto: École Polytechnique Fédérale de Lausanne
Bereits geringfügige Abweichungen im Durchmesser der Mikrokanäle lassen diagnostische Mikrofluidik-Plattformen jedoch versagen. Digitale Mikrofluidik-Chips kommen deshalb ganz ohne Mikrokanäle aus. Sie bewegen Mikrotropfen durch die sogenannte Elektrobenetzung, bei der elektrische Felder die Oberflächenspannung von Flüssigkeiten ändern, um sie zu manipulieren. Tröpfchen können so „programmiert“ werden, sich zu vereinen oder sich zum Detektor zu bewegen.
So konstruierte das Start-up Annaida beispielsweise einen NMR-Sensor von der Größe eines Objektträgers, der 3D-gedruckte Mikrokanäle mit On-Chip-integrierten NMR-Transceiver- und Detektor-Schaltkreisen kombiniert. Er kann Volumina von zehn Nanolitern bis einhundert Pikolitern auslesen, das Detektionslimit liegt bei fünf Pikomol Protonen. Der NMR-Sensor wurde für den Einsatz in konventionellen, supraleitenden NMR-Magneten entworfen, denn bei entsprechend starkem Magnetfeld muss er nicht mehr über ein Zielstruktur-Ensemble mitteln, sondern detektiert individuelle Merkmale einzelner Zellen oder Organismen wie C. elegans nicht-invasiv und quantitativ. Das könnte beispielsweise In-vitro-Fertilisationszentren dabei helfen, die Kulturbedingungen besser zu überwachen und würde ihnen die Embryonenauswahl erleichtern. Nicht zufällig trägt Annaidas NMR-Sensor den Namen EmbryoSpin.