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(09.06.2021) Für die Zellsortierung braucht es nicht unbedingt Fluoreszenz-Marker. Dank künstlicher Intelligenz lassen sich Zellen auch mithilfe von Durchlicht-Bildern, mechanischen Eigenschaften oder Raman-Spektren sortieren.

Moderne Durchflusszytometer können mithilfe von Fluoreszenz-Markern zehntausende Zellen pro Sekunde sortieren und mehr als zwanzig Farben auseinanderhalten. Der hierfür verwendete Begriff Fluorescence-Activated Cell Sorting oder FACS ist eigentlich ein eingetragener Markenname des Cell-Sorter-Pioniers BD Biosciences. Er wird inzwischen aber synonym für alle fluoreszenzbasierten Durchflusstechniken verwendet, welche die Zellen in winzigen Tröpfchen vereinzeln und dann über statische Aufladung sortieren.

Die hierfür eingesetzten Fusionsproteine, wie GFP, beeinträchtigen aber meist auch andere Zellfunktionen – ebenso wie fluoreszierende Antikörper auf oder in der Zelle. Für den klinischen Einsatz muss man sowieso auf transgene Labels verzichten – etwa wenn die Zellen eines Patienten für therapeutische Zwecke wiederverwendet werden.

FACS und Co. können Zellen aber auch ohne Fluoreszenz-Marker identifizieren. Je größer eine Zelle ist, desto stärker streut sie Licht, das auf sie fällt, nach vorne. Und je komplexer ihre Struktur, desto ausgeprägter ist die seitliche Streuung. Beide Parameter kann man unabhängig voneinander bestimmen und damit auch ohne Fluoreszenz-Markierung zum Beispiel Granulozyten von T-Zellen unterscheiden.

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„Hierauf kann man sich aber nicht verlassen, wenn sich die untersuchten Zellen stark in ihrem Brechungsindex unterscheiden“, wirft der Physiker Maik Herbig ein. Kennt man den Refraktionsindex nicht, lassen sich Größe und Struktur der Zellen nicht mehr sicher abschätzen. Viel praktischer wäre es, wenn ein Zellsortiergerät die Zellen „anschauen“ würde und dann anhand einer lichtmikroskopischen Aufnahme entscheidet, welche es auswählen muss.

Wie gut Mustererkennung bereits funktioniert, weiß jeder, der schon mal die reverse Bildersuche bei Google verwendet hat. In einem Bild-basierten Durchflusszytometer müssten die Zellbilder jedoch extrem schnell erkannt und zugeordnet werden, wenn das Gerät auch bei der Sortier-Geschwindigkeit mit einem klassischen FACS mithalten soll.

Herbig absolvierte seine Doktorarbeit an der Technischen Universität Dresden in der Arbeitsgruppe von Jochen Guck. Sein Doktorvater ist inzwischen nach Erlangen ans Max-Planck-Zentrum für Physik und Medizin umgezogen; beide Labore arbeiten aber noch immer eng zusammen. Während seiner Promotion hat Herbig die Bilderkennung optimiert und neuronale Netzwerke trainiert, damit die Software Zellen zuverlässig und schnell erkennt. „Bei künstlicher Intelligenz und maschinellem Lernen denkt man zuerst an leistungsfähige Grafikkarten und Serverfarmen, die man von Amazon mietet und ansteuert“, erklärt Herbig. „Aber wir möchten ja innerhalb von wenigen hundert Mikrosekunden eine Antwort auf das Bild haben, und vor einigen Jahren hätte man wahrscheinlich gesagt: Das geht nicht!“

Damit gab sich Herbig aber nicht zufrieden. Künstliche Intelligenz kopiert das Prinzip eines biologischen Nervensystems – auch wenn künstliche neuronale Netze natürlich viel einfacher gebaut sind als ein Gehirn. Herbig verwendet für seine Arbeit ein sogenanntes mehrlagiges Perzeptron (Multilayer Perceptron oder MLP). Bei der Bildverarbeitung beginnt alles mit den Bildpixeln. Jedem Pixel ist im Fall eines lichtmikroskopischen einfarbigen Bildes ein Helligkeitswert zugeordnet. Über mehrere Schichten oder Layer simulierter Neurone sind in einem MLP letztlich alle Pixel miteinander verknüpft und werden verrechnet. Was genau der Algorithmus warum macht, weiß auch der Entwickler nicht, denn das Netzwerk wird auf eine bestimmte Aufgabe hin trainiert und optimiert sich selbst (siehe hierzu auch LJ 3/2019, Seite 16, Link).

Die Neuronen der verschiedenen Schichten sind nicht wirklich parallel verschaltet wie in einem echten Gehirn, sondern durch Rechenoperationen verbunden, die ein Computer abarbeiten muss. „Je mehr Pixel ein Bild hat, desto länger dauert die Berechnung. Ich habe deshalb zunächst geschaut, ob man wirklich die gesamte Aufnahme braucht“, erklärt Herbig. Die Kamera des Sortiergeräts nimmt Fotos mit einer Größe zwischen 100 x 40 und 250 x 100 Pixeln auf. „Irgendwo in diesen Bildern versteckt sich die Zelle“, erläutert Herbig. „Und für die Bildauswertung brauche ich ja nur die Pixelbox mit der Zelle.“ Im Rückblick beschreibt Herbig die Idee als „eigentlich ganz simpel“, aber letztlich sei diese Auswahl die eigentliche Magie hinter der Bildverarbeitung.

Durch das dünne Kanälchen im Zytometer, das die Zellen einzeln durchlaufen, fließt vor allem Flüssigkeit. Auf den meisten Fotos sind also gar keine Zellen zu sehen – sie enthalten überhaupt keine sinnvolle Information. „Das ist einfach nur Hintergrund, und wenn wir diesen Hintergrund vom jeweils folgenden Bild wieder abziehen, erkennt man eine Zelle sehr leicht.“ Im Prinzip sei das Verfahren also eine Rauschunterdrückung. Als Nächstes wird in Echtzeit eine Kontur detektiert und eine sogenannte Bounding Box um die erkannte Struktur gelegt – die relevanten Pixel werden praktisch eingerahmt. „Diese Operationen schafft der Computer extrem schnell, und hier können wir schon mal entscheiden, ob wir die Zelle überhaupt brauchen.“ Elastische Zellen wie rote Blutkörperchen werden zum Beispiel stark in die Länge gezogen. So lässt sich allein an Form und Größe der Bounding Box eine Vorauswahl treffen.

Meist habe das neu generierte Bild mit der Zelle dann eine Größe von etwa 36 x 36 Pixeln. „Das ist eine Bildgröße, für die MLPs sehr effizient sind und schnell genug zum Sortieren. Die Berechnungszeit beträgt etwa 120 Mikrosekunden – da war ich selbst überrascht“, meint Herbig. In der Praxis schaffe man, so der Physiker, zuverlässig fünfzig Zellen pro Sekunde. „Theoretisch kämen wir wahrscheinlich auch an die 300 Zellen pro Sekunde heran, aber da müsste die Konzentration schon sehr hoch sein, und man hätte auch häufiger mal eine falsche Zelle mit dabei.“ Vor diesem Spagat zwischen Ausbeute und Reinheit steht man aber grundsätzlich bei der Zellsortierung. Herbig spricht von „yield versus concentration“. Will man beides, muss man entsprechend mehr Zeit einplanen.

Die labelfreie Zellsortierung, an der Herbig mitgearbeitet hat, berücksichtigt aber noch einen weiteren Parameter: die Verformbarkeit der Zellen. „Jochen Guck interessiert sich für Zellmechanik, und ich glaube, wenn es dazu schon gute Techniken gäbe, würde er diese für die Forschung nutzen“, vermutet Herbig.

Da Methoden zur Zellmechanik-Messung bislang aber rar oder umständlich sind, entwickelt Guck sie selbst. So auch für die Zellsortierung. „Wir lassen die Zelle relativ schnell durch einen Kanal fließen, der nur wenig breiter ist als die Zelle selbst. Aufgrund des parabolischen Strömungsprofils in diesem Rohr fließt die Flüssigkeit am Rand langsamer als in der Mitte“, beschreibt Herbig das Prinzip und nennt als Beispiel ein Schiff, das auf einem Fluss unterwegs ist. In der Mitte des Flusses ist die Strömung am stärksten, am Rand ist sie schwächer. Bei einem Schiff, das beinahe so breit ist wie der Fluss, wirkt hierdurch eine Kraft auf das Schiff ein. „Das Schiff kommt ja an seinen Rändern langsamer vorwärts als in der Mitte“, so Herbig. „Ebenso wird eine Zelle dann auseinandergezogen.“ Wie stark die Zelle deformiert, hängt von ihren mechanischen Eigenschaften ab, die zum Beispiel durch Zytoskelett und Membran-Zusammensetzung beeinflußt werden. Man weiß aber zunächst nicht, ob eine Zelle von vornherein eine längliche Form hat oder erst durch die Kräfte im Kanal verformt wurde. „Deswegen machen wir für die Zellmechanik immer zwei Messungen: einmal vor dem Kanal, damit wir den nicht-deformierten Zustand kennen, und im Kanal. Die beiden Messungen kann man dann voneinander subtrahieren.“

Im Kanal entsteht auch das lichtmikroskopische Foto, das mithilfe des neuronalen Netzes ausgewertet wird. Das stellt besondere Anforderungen an die Hardware, erläutert Herbig: „Damit diese Kräfte überhaupt auftreten, sind wir gezwungen, die Zellen mit hoher Geschwindigkeit durch den Kanal zu schicken. Hierdurch bekommen wir ein Problem, das man aus der Sportfotografie kennt: Die Fotos wirken verschwommen.“ Folglich braucht man eine sehr kurze Belichtungszeit, in der sich das Objekt kaum weiterbewegt. „Wir arbeiten deswegen mit einer LED, die kurze Lichtpulse generiert, die nur zwei Mikrosekunden dauern.“ Das Ganze ist mit einem Hellfeld-Mikroskop und einer Hochgeschwindigkeitskamera kombiniert.

Vorgestellt haben die Forscher aus Dresden und Erlangen die labelfreie Sortierung vor einem Jahr in Nature Methods (17(6): 595-9). Sie verwendeten dazu ein sogenanntes RT-FDC-Gerät, das ebenfalls im Guck-Labor entwickelt wurde. RT-FDC steht für Real-Time Fluorescence and Deformability Cytometry (Nat. Methods 15(5): 355-8). Das inzwischen auch kommerziell erhältliche RT-FDC verknüpft die Fluoreszenz-Messungen mit der Deformations-Zytometrie. „Das ermöglichte mir, sehr schnell Daten zu generieren, um das neuronale Netz zu trainieren“, blickt Herbig zurück.

Denn zur Kontrolle hatte er neben dem lichtmikroskopischen Foto auch das Fluoreszenz-Signal zur Hand, um das Netzwerk anzuleiten. „Wir haben zur Kontrolle Zellen sortiert, die noch nicht gefärbt waren“, beschreibt Herbig die Experimente, mit denen die Arbeitsgruppe das neuronale Netz auf seine Zuverlässigkeit hin überprüfte. „Die Zellen haben wir erst danach gefärbt und dann geschaut, ob es wirklich die richtigen waren.“

Hat man erst einmal ein neuronales Netz zum Sortieren bestimmter Zellen validiert, kann man labelfrei sortieren und kommt ohne Fluoreszenz-Markierung aus. „soRT-FDC“ nennt sich dieses Verfahren (sorting RT-FDC). Grundlage ist die gleiche in Dresden entwickelte Mikrofluidik-Plattform wie beim RT-FDC, die sich weiter anpassen lässt. Für die aktuelle Methode wird ein Chip verwendet, auf dem die erkannten Zellen durch Schallwellen „angeschubst werden“, wie es Herbig ausdrückt, um in eine Abzweigung zu gelangen. „Wir haben damit ein Sortiersystem, bei dem wir jede Komponente für den Einmalgebrauch einsetzen können“, freut sich Herbig und nennt als mögliche Anwendung die Zellsortierung für Therapieverfahren.

Bislang gebe es zwei dieser speziell angepassten soRT-FDC-Geräte – jeweils eines in Dresden und Erlangen. Die Hardware ist aber noch nicht so weit optimiert, dass man sie quasi „per Knopfdruck“ einsetzen kann. Allerdings wirken die Forscher um Guck und Marius Aders Gruppe in Dresden, zu der auch Herbig noch gehört, ohnehin häufig als Kooperationspartner an Studien mit. „Mit den Unikliniken in beiden Städten sind wir sehr gut vernetzt und haben auch schon menschliche Blutproben am RT-FDC gemessen“, berichtet Herbig.

Er nutzt soRT-FDC derzeit, um Retina-Zellen aus der Maus zu erkennen. Im Gegensatz zu Blutproben steht man beim Herauslösen von Zellen aus Geweben vor weitaus größeren Herausforderungen, weiß Herbig. „In diesen dissoziierten Geweben hat man noch viele Zellaggregate und Dreck, und alles klebt gern zusammen. Daher habe ich mir Gedanken gemacht, wie man diese Probleme lösen kann.“

Hierzu ist ganz aktuell ein Preprint auf bioRxiv verfügbar. Es enthält ein Protokoll, das die Aufbereitung von Gewebe für die labelfreie Zytometrie sowie das Training neuronaler Netze für die Erkennung von Photorezeptoren beschreibt (doi: 10.1101/2021.05.05.442869).

Künftig möchte Herbig die Deep-Learning-Technologie leichter und plattformübergreifend zugänglich machen. „Ich habe eine Software geschrieben, in der man per Drag and Drop Bilder einfügen kann. Über ein Drop-Down-Menü sucht sich der Anwender dann ein neuronales Netz aus und muss nur noch auf einen Knopf drücken, um sein Modell zu trainieren.“ Bislang ist das Programm für die institutseigene RT-FDC-Sortiermaschine optimiert. Herbig möchte die Software aber auch für andere Geräte und Verfahren anpassen. Sein nächstes Projekt führt ihn nach Tokio in das Labor von Keisuke Goda. „Eigentlich wäre ich schon dort, aber durch Corona hat sich alles verzögert.“

Die Forscher im Goda-Lab sind auf die Entwicklung neuer Zellsortiermethoden spezialisiert und widmen sich derzeit der Raman-Spektrometrie. Im Sommer letzten Jahres veröffentlichten sie einen Artikel in Nature Communications zum Raman Image-Activated Cell Sorting (RIACS; 11(1): 3452). Ihr Ziel ist es, die Raman-Spektrometrie für den hohen Durchsatz zu optimieren.

Was verbirgt sich hinter dem Raman-Effekt beziehungsweise der Raman-Streuung? In Molekülen und Kristallgittern vibrieren die Elektronen auf einem bevorzugten Energieniveau. Absorbiert ein Elektron ein Photon, kann es auf ein etwas höheres „virtuelles Niveau“ springen. Im Gegensatz zur Anregung durch Fluoreszenz handelt es sich nicht um ein stabiles Energieniveau – meist gibt das Elektron sofort wieder ein Photon gleicher Energie ab. Von außen betrachtet ist also nichts passiert. In seltenen Fällen gelangt das Elektron aber nicht zurück auf sein Grundniveau, sondern bleibt auf einem geringfügig höheren Niveau stehen. Es „fällt“ also nicht so tief, wie es angehoben wurde. Das in diesem Fall abgestrahlte Photon ist ein bisschen energieärmer – oder anders ausgedrückt: Seine Wellenlänge ist etwas größer.

Wird ein bereits angeregtes Elektron durch einen Laserstrahl auf ein noch höheres virtuelles Niveau angehoben, fällt es zumeist wieder auf den Grundzustand zurück. Dabei gibt es ein geringfügig energiereicheres Photon ab, da es tiefer gefallen ist, als es vorher angehoben wurde.

Bei der Raman-Streuung detektiert man also zusätzliche Wellenlängen, die leicht über oder unter der Anregungswellenlänge liegen. Einzelne Elektronenpaarbindungen zwischen Atomen erkennt man auf diese Weise an ganz charakteristischen spektralen Fingerabdrücken. Tatsächlich kann man über die Lichtpolarisation eines Lasers auch Molekülanordnungen in Kristallen rekonstruieren – und sie lässt auch Rückschlüsse auf die Temperatur einer Substanz zu.

Für die Zytometrie ist die Raman-Streuung interessant, weil man mit ihr Zellen allein anhand der darin enthaltenen Moleküle charakterisieren kann – also ebenfalls ohne künstlich zugefügte Fluoreszenz-Label. Was in der Theorie simpel klingt, ist in der technischen Umsetzung aber ganz und gar nicht trivial. Die Raman-Anregung ist extrem selten. Moleküle, die in geringer Konzentration vorliegen, liefern kaum Signale und sind sehr schwer nachweisbar. Goda und Kollegen schaffen es derzeit, rund einhundert Events pro Sekunde automatisiert im Raman-Zytometer zu erfassen. Ein Event bedeutet aber nicht, dass wirklich eine Zelle erkannt und ausgewählt wurde. Ereignisse können auch eine später verworfene Zelle oder Schwebstoffe in der Probe sein. Die Zahl steht nicht für die Ausbeute.

Ein Team um Roman Stocker an der Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich nutzt zusammen mit Kollegen aus Wien und Uppsala ebenfalls die Raman-Streuung für die Zellsortierung. Die Forschenden wollen mit ihr gezielt Mikroorganismen aus Proben herauspicken, zum Beispiel aus Meeressedimenten. Die Details hierzu veröffentlichte die Gruppe Anfang des Jahres in Nature Protocols (16(2): 634-76). Im Hinterkopf hatte sie dabei Metagenom-Analysen. „Die Anwesenheit eines Gens zu detektieren, bedeutet nicht unbedingt, dass die Zellen die damit assoziierte Funktion auch wirklich ausüben“, schreiben die Autoren in ihrem Paper. Ein wichtiger Fokus des Artikels liegt daher auf der Vorbereitung der Proben. Im ersten Schritt werden die Organismen kultiviert. Das Team beschreibt unter anderem auch anaerobe Kulturbedingungen, um zum Beispiel Darm-Mikroben am Leben zu halten. In die Nährmedien werden stabile Isotope wie Deuterium oder 13C gegeben. Nur Zellen, die metabolisch aktiv sind, bauen diese in ihre Biomoleküle ein. Da auch die Elektronenpaarbindungen zu diesen Isotopen charakteristische Raman-Signaturen zeigen, lassen sich die tatsächlich aktiven Zellen aussortieren. Dazu werden sie mit einer optischen Pinzette in dem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom des Geräts festgehalten und herausgefischt. Anschließend können die Forscher die Genome analysieren ohne befürchten zu müssen, irrelevante Fremdsequenzen zu erfassen. Auch eine Kultivierung ist prinzipiell möglich, da die Sortiermethode die Zellen schont.

Für die Zytometrie und die Entscheidungsprozesse beim Sortieren setzt das Team ebenfalls auf maschinelles Lernen. Im Vergleich zur klassischen Durchflusszytometrie scheinen die Durchsatzraten aber ernüchternd. In Stockers Paper ist von einer Ausbeute von 500 Zellen pro Stunde (!) die Rede. Allerdings käme man bei einer Sortierung per Hand mittels Raman-Spektroskopie auf nur rund zwei Zellen pro Stunde, sodass die Automatisierung bereits einen Zeitgewinn um zwei Größenordnungen darstellt. Zudem sollte man bedenken, dass es um ganz andere Fragestellungen geht als etwa bei der Analyse von Blutzellen.

Im Alltag einer Core Facility spielt die klassische Durchflusszytometrie aber immer noch eine Schlüsselrolle, weiß Elmar Endl, der am Uniklinikum Bonn unter anderem den Betrieb der Großgeräte koordiniert. „Geschichtlich kommt das Prinzip der Tröpfchensortierung aus der Entwicklung des Tintenstrahldruckers, und jeder weiß ja, wie schnell ein Tintenstrahldrucker Tröpfchen in bestimmte Richtungen leiten kann.“ Somit spielen auch Fluoreszenz-Label nach wie vor eine große Rolle. Spannend findet Endl die Idee, irgendwann einmal den 3D-Druck auf die Zytometrie zu übertragen und gewebeartige Zellkulturen zu generieren. „Das ist momentan wirklich noch Forschung“, betont Endl. „Aber wenn man Kollagenfasern druckt – wieso kann man dann nicht gleich auch Zellen aussortieren und an der korrekten Stelle im Gewebe platzieren?“

Auch chipbasierte Zytometer tauchen inzwischen vermehrt in den Großzentren auf, die zum Beispiel eingesetzt werden, wenn die Proben besonders rein bleiben müssen. Umgekehrt sind mit diesen Geräten auch abgeschlossene Systeme für den Umgang mit hochinfektiösem Material realisierbar – was mit einem FACS der alten Schule nicht möglich ist.

Bis die neuen labelfreien Methoden samt KI-Mustererkennung im großen Stil in die Labore einziehen, wird es aber wohl noch etwas dauern. Doch schon jetzt werden viele neue Sortier-Ideen in Forschungsprojekten umgesetzt, die das bloße Proof-of-Concept-Stadium bereits hinter sich gelassen haben.