(09.06.2021) In der Welt der Mikroskopie dreht sich (fast) alles um die Auflösung. Die bisherigen Grenzen der superauflösenden Technologien lassen sich durch Kombination mit der Expansionsmikroskopie deutlich nach unten verschieben.
Vor einigen Jahren überraschten Fei Chen, Edward Boyden und Kollegen vom Massachusetts Institute of Technology in Cambridge (USA) mit einer technisch schlichten, aber – man möchte fast sagen – genialen Idee: Sie hatten die Expansionsmikroskopie (ExM) entwickelt, mit der sich die Auflösung der Lichtmikroskopie, die auf die halbe Wellenlänge des Lichts begrenzt ist, deutlich steigern lässt (Science 347(6621) 543-8; LJ 5/2019, Seite 54, Link). Durch das Aufblähen der Probe mithilfe Acrylamid-haltiger, quellfähiger Hydrogele um das gut Vierfache erreichten die Forscher damals siebzig Nanometer transversale Auflösung (xy-Ebene). Sie bewegten sich damit in den Sphären der superauflösenden Nanoskopie – mit einem konfokalen Mikroskop. Das war schon super, es geht aber noch besser.
Inzwischen wurden die Protokolle für die Fixierung der Zellen und ihrer Bestandteile in dem Hydrogel verfeinert. Mit Protein-Retention-ExM (ProExM) beispielsweise lassen sich Proteine chemisch mit Matrixmolekülen verbinden und damit immobilisieren. Man kann Proben mehrfach nacheinander expandieren und gelangt so zu einer vierzigfachen Vergrößerung des Volumens. Nutzt man dann zur Abbildung die Strukturierte Illuminationsmikroskopie (SIM) oder eine Nanoskopie-Technologie, lässt sich deren Auflösungsvermögen noch mal um den Faktor der Expansion steigern.
Pan-neuronale Markierung proteindichter Strukturen mittels NHS (N-Hydroxysuccinimid)-Farbstoff-Konjugat (magenta) und Visualisierung synaptischer Vesikel (grün) nach vierfacher Expansion. Aufnahme: Markus Sauer
Mit der Entwicklung der hierfür nötigen Methoden beschäftigen sich Markus Sauer und seine Mitarbeiter im Department für Biotechnologie und Biophysik der Universität Würzburg. Zunächst war eine grundsätzliche Frage zu klären: Markiert man die Proben mit Antikörper-gekoppelten Fluorophoren besser vor oder nach der Expansion? Nachher ist besser, und das aus zwei Gründen. Erstens ist bei der nachträglichen Markierung der sogenannte Linkage Error niedriger. Dieser beschreibt den Fehler bei der Lokalisation, der entsteht, weil die markierten Antikörper eine gewisse physikalische Ausdehnung haben. Der Linkage Error bei der Immunfluoreszenz-Mikroskopie mit primären und sekundären Antikörpern beträgt 17,5 Nanometer. Das ergaben Messungen an elektronenmikroskopischen Bildern. Die markierte Struktur erscheint im Bild also wesentlich größer als sie tatsächlich ist. Markiert man die Probe vor der Expansion, werden nicht nur die Abstände zwischen den Antigenen größer, sondern auch die zwischen den Antikörpern und den Antigenen. Der Linkage Error vergrößert sich also entsprechend dem Expansionsfaktor. Markiert man aber erst nach Quellen des Hydrogels, sind zwar die Antigene um den Expansionsfaktor auseinandergedriftet, doch die nachträglich applizierten Antikörper binden eng an ihre Ziele, also ohne diesen Faktor. Somit sinkt der Linkage Error bei nachträglicher Markierung und die Genauigkeit der Lokalisation steigt. Die nachträgliche Markierung ist aber auch besser, weil zwischen den auseinandergetriebenen Molekülen Platz ist, in dem die Antikörper an zuvor verdeckte Antigene und Epitope binden können. „Man hat dann viel mehr Signal“, sagt Sauer.
Wie weit sie mit einer Kombination von ExM und der lichtmikroskopischen SIM kommen würden, untersuchten das Würzburger Forschungsteam an verschiedenen Modellsystemen, unter anderem an synaptonemalen Komplexen von Mäusen. Das sind Chromosomenstrukturen, die während der Prophase der Meiose I entstehen. Dabei liegen die gepaarten Chromosomen nebeneinander. Das Gebilde sieht wie eine Leiter aus, wobei über Proteine kondensierte und stabilisierte Chromosomen die Holme bilden – um im Bild zu bleiben – und über Sprossen aus Proteinen miteinander verbunden sind.
In den Holmen sitzen unter anderem synaptonemale Komplexproteine SYCP3: sie verdichten die chromosomale DNA. Die Auflösung mit der strukturierten Illuminationsmikroskopie ist um den Faktor zwei besser als die Physik eigentlich erlaubt. Sie liegt bei 120 Nanometern in der xy-Ebene. Damit lassen sich die individuellen Holme allerdings nicht darstellen. Doch mit der ExM-SIM gelang es, die individuellen Strukturen abzubilden, und zwar mit einer Auflösung von zwanzig bis dreißig Nanometern (Nat. Comm. 11: 3222) – was zuvor nur mit dSTORM möglich war (PNAS 112: 2029). „STORM oder dSTORM funktioniert nur mit ausgewählten Farbstoffen und maximal zwei Farben wirklich gut und 3D-Imaging bleibt aufwendig“, erklärt Sauer. „Demgegenüber kann man die 3D-SIM mit vier Farben durchführen.“ Ein enormer Vorteil.
Eine Kombination von ExM mit einer Nanoskopie-Technologie verspricht eine noch bessere Auflösung. Zehn bis zwanzig Nanometer seien jetzt für jeden erreichbar, schrieb Sauer im Wiley Analytical Science Magazine. Tatsächlich? „Prinzipiell schon, aber man muss die Expansion der Proben im Griff haben und dafür sorgen, dass sie wirklich isotrop, also völlig gleichmäßig, expandieren. Das ist nach unseren Erkenntnissen die größte Fehlerquelle.“
Mit Kollegen anderer Universitäten, darunter auch dem ExM-Pionier Edward Boyden, probierten die Würzburger verschiedene Expansions-Protokolle aus (Nat. Methods 16: 71). Test- beziehungsweise Kontrollobjekte waren die bereits umfassend beschriebenen Zentriolen. „Nur eine Methode hat funktioniert. Mit den anderen hatten wir manchmal Strukturen, die nicht mal annähernd wie Zentriolen aussahen“, berichtet Sauer. Wer mit solchen Untersuchungen beginnen möchte, dem empfiehlt der Experte deshalb, erst an Clathrin-beschichteten Vesikeln auszutesten, ob mit dem verwendeten Verfahren die Gewebe-Expansion wirklich gleichmäßig ist.
Die ExM-dSTORM-Kombination testeten die Forscher an Mikrotubuli. Die sind 25 Nanometer im Querschnitt groß. Markiert man sie mit primären und sekundären Antikörpern, erreichen sie auf dem dSTORM-Bild 60 Nanometer im Querschnitt – das ist der Effekt des Linkage Errors. Auch diese Proben markierte die Gruppe deshalb nach der Expansion. Dabei tauchte allerdings ein Problem auf: Die Proben schrumpften in dem für die STORM-Markierung nötigen salzhaltigen Puffer wieder. Warum? Die Expansions-Polymere sind geladen. Diese Ladungen stoßen sich ab, die Wassermoleküle können sich dazwischen einlagern. Das ist die Basis der enormen Ausdehnungskapazität. Salze neutralisieren die Ladungen, deshalb fallen die Hydrogele darin wieder in sich zusammen. Um das zu verhindern, fixierten die Forscher die Proben nach der Expansion ein zweites Mal, und zwar mit einem ungeladenen Gel, dessen Struktur sich unter dem Einfluss der Puffersalze nicht verändert. Mit der nach der Expansion markierten ExM-dSTORM erzielte Sauers Team Auflösungen von deutlich unter 15 bis 20 Nanometern.
Diese Werte kann man auch erreichen, wenn man die ExM mit STED (Stimulated Emission Depletion) kombiniert, wie die Arbeitsgruppe von Helge Ewers (Freie Universität Berlin) und Kollegen vom Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik in Dresden vorführten (ACS Nano 12: 478; Methods in Cell Biol. 161: 15).
„Das Schöne an der Expansionsmikroskopie ist, dass die Proben hoch transparent sind“, so Sauer. Man kann also auch gut in die Tiefe gehen und 3D-Bilder generieren. „Allerdings sind die Signale durch die Expansion weiter auseinander, die Probe insgesamt natürlich größer.“ Auf einer 80 x 80 x 15 Mikrometer großen Probe bildeten die Forscher beispielsweise das gesamte Chromosomen-Set eines Spermiums ab – mit überraschend detaillierten Strukturen der Moleküle. Auf solch großen Proben fänden Ungeübte die Signale mitunter gar nicht, ist Sauer überzeugt. Darum der Rat: Wer sich damit befassen möchte, sollte bei den Experten in die Lehre gehen.
Und was kommt jetzt, nach der Super-Resolution? Klar, darauf kann nur die Ultra-Resolution folgen. Ein bis zwei Nanometer ist das Ziel. Um das zu erreichen, taten sich die Teams von Sauer, Sylvio Rizzioli (Göttingen) und Boyden zusammen. „Wenn uns das gelingt, können wir tatsächlich einzelne Proteine sehen und das Geschehen in Synapsen molekular verfolgen,“ sagt Sauer. Für die Entwicklung der Ultra-Resolution durch Verzahnung von ExM und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) machte der Europäische Forschungsrat elf Millionen Euro für einen ERC Synergy Grant locker. Mitte des Jahres startet das Projekt.