(10.11.2021) Ein optogenetisches CRISPR-Cas-System ermöglicht die Aktivierung oder den Knock-down beliebiger Gene. Doch nicht nur das: Forscher können mit dem neuen Tool die RNA-Menge in komplexen Organoiden manipulieren – räumlich präzise und genspezifisch.
Wer einen Nobelpreis gewinnen möchte, muss in der Regel geduldig sein. Das Nobelkomitee lässt aussichtsreiche Kandidaten gerne etwas länger warten. Nicht selten vergehen Jahrzehnte, bis eine Entdeckung oder Erfindung von der Stockholmer Jury prämiert wird. Was im Einzelfall durchaus tragisch sein kann, weil der Preis nicht posthum verliehen wird, ist aus wissenschaftlicher Sicht nachvollziehbar. Wie gewinnbringend eine Forschungsleistung für das jeweilige Feld ist, zeigt sich oft erst nach Jahren.
Doch manchmal geht es auch deutlich schneller: 2020 ging der Nobelpreis für Chemie an die Molekularbiologinnen Emmanuelle Charpentier und Jennifer A. Doudna. Die Forscherinnen hatten acht Jahre zuvor das CRISPR-Cas9-System als Teil der adaptiven Immunabwehr von Prokaryoten beschrieben. Der entscheidende Punkt für das Nobelkomitee war aber vermutlich, dass die beiden erkannten, wie sich CRISPR-Cas9 zur präzisen Editierung des Genoms nutzen lässt.
Mit dem Laser-Scanning-Mikroskop steuern Alessandra Zappulo (li.) und Lisa Emmenegger aus Nikolaus Rajewskys Gruppe ein optogenetisches CRISPR-Cas-System, das die Expression beliebiger Gene in Organoiden räumlich präzise induziert oder ausschaltet. Foto: Gruppe Rajewsky
Das CRISPR-Cas-Grundprinzip ist simpel: Eine kurze single-guide-RNA (sgRNA) bindet die Endonuklease Cas9 an deren RNA-Bindedomäne und navigiert sie zum Abschnitt des Genoms, der editiert werden soll. Damit die sgRNA diesen findet, enthält ihr nicht an Cas9 gebundener Teil die komplementäre Basenfolge der Zielsequenz. Sobald die sgRNA an diese andockt, induziert die mitgeschleppte Cas9 einen DNA-Doppelstrangbruch, den das zelleigene DNA-Reparatur-System mehr schlecht als recht wieder zusammenfügt, was letztlich zu einem Gen-Knock-out führt.
Das CRISPR-Cas9-System ist einfacher zu handhaben, flexibler zu steuern und viel effizienter als vergleichbare Werkzeuge zur Geneditierung. Inzwischen ist die moderne Molekularbiologie ohne CRISPR-Cas nicht mehr vorstellbar und die unzähligen Anwendungen des Systems sind kaum noch zu überblicken. Neben klassischen Knock-outs lassen sich mit CRISPR-Cas auch Punktmutationen, Deletionen sowie Insertionen ins Genom einfügen. Zudem kann man mit der Technik die Genexpression inhibieren oder aktivieren und Knock-downs via CRISPR-vermittelter RNA-Interferenz auslösen. Wer will, kann CRISPR-Cas auch pharmakologisch oder optogenetisch steuern. Angesichts der zahllosen Arbeiten zu CRISPR-Cas drängt sich fast die Frage auf: Ist die Methode nicht so langsam ausgereizt?
Ivano Legnini, Postdoc in Nikolaus Rajewskys Gruppe am Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB) des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin, würde diese Frage wohl verneinen. Vor wenigen Wochen veröffentlichte Rajewskys Team ein Preprint mit Legnini als Erstautor, in dem es ein optogenetisches CRISPR-Cas-System beschreibt (bioRxiv doi: 10.1101/2021.09.26.461850). Die Berliner entwickelten CRISPR-Werkzeuge zur Aktivierung beziehungsweise Inhibierung der Genexpression so raffiniert weiter, dass sie mit hoher räumlicher Auflösung in Organoiden induzierbar sind.
Aber der Reihe nach. Als Einstieg hilft ein Blick in Legninis Vita. Nach seinem Studium mit Schwerpunkt Genetik und Molekularbiologie untersuchte er als Doktorand an der Universität La Sapienza in Rom die Expression und Funktion nicht-codierender RNA, etwa mikroRNA (miRNA) sowie zirkuläre RNA (circRNA). Dazu nutzte er damals brandneue Techniken der räumlichen Transkriptomik (Spatial Transcriptomics), mit denen Forscher die Expression eines Transkripts in einer definierten Region eines Gewebes analysieren können.
Für Legnini, der seit 2017 als Postdoc in Rajewskys Gruppe arbeitet, sind diese neuen Methoden bahnbrechend: „Die moderne Transkriptomik hat unseren Blick auf biologische Systeme verändert. Wir können heutzutage die embryonale Entwicklung ganzer Gewebe analysieren, und zwar auf Einzelzellebene. Wir können vorhersagen, welche Gene in welchem Entwicklungsschritt des Embryos in welchen Zellen exprimiert werden und wie dies die Migration, Interaktion oder Differenzierung dieser Zellen untereinander beeinflusst. Anders formuliert: Die deskriptiven Möglichkeiten sind beeindruckend.“
Allerdings wollten sich Legnini und seine Forscherkollegen nicht mit der reinen Beschreibung des Ist-Zustands zufriedengeben. Die Idee: Wenn man das Dickicht der Signalkaskaden komplexer zellulärer Prozesse, beispielsweise in der Embryonalentwicklung, durchdringen möchte, muss man es aus dem Tritt bringen. Erst dann werden kausale Beziehungen und Interaktionen besonders deutlich.
Die Forscher suchten also nach einem Weg, das System zu stören. Legnini skizziert die Anforderungen: „Wir benötigten ein Werkzeug, mit dem wir die RNA-Expression jedes beliebigen Gens zu einem von uns gewählten Zeitpunkt an- und ausschalten können. Und zwar räumlich eng begrenzt, also auf Ebene einzelner Zellen oder Zellverbänden.“
Der Molekulargenetiker betont, dass sie das Rad hierzu nicht komplett neu erfinden mussten. „Es existieren schon einige bemerkenswerte Techniken. Allerdings gibt es meines Wissens kein System, das in komplexen Gewebestrukturen funktioniert. Doch genau da müssen wir hin, wenn wir physiologisch relevante Forschung machen wollen. Die zweidimensionale Zellkultur hilft uns auf lange Sicht nicht weiter.“
Den Ausgangspunkt der Berliner bildete ein gesplittetes CRISPR-Cas9-basiertes photoaktivierbares Transkriptionssystem (SCPTS) einer japanischen Gruppe (Nature Meth. 14: 963-6). Beim SCPTS wird eine enzymatisch inaktive Form von Cas9 (dead Cas9 oder dCas9) in der Zielzelle exprimiert. dCas9 ist zweigeteilt, jede Hälfte ist mit einem Teil des nMag-pMag-Photoschalters getaggt. Wird die Zelle mit Blaulicht bestrahlt, dimerisieren nMag und pMag und damit auch die dCas9-Hälften – das Protein wird aktiviert. Eine sgRNA, die mithilfe eines zusätzlichen Plasmids in die Zelle eingeschleust wird, navigiert dCas9 in die Promotorregion des gewünschten Gens. Dort angekommen kurbeln mehrere an dCas9 gebundene Transkriptionsfaktoren die Expression des Zielgens an.
Rajewskys Gruppe erweiterte die SCPTS-Methode mit einer CasRx-Expressionskassette. CasRx gehört zu den Cas-Proteinen, die statt DNA spezifisch RNA editieren. Dazu wird es von einer passenden sgRNA zur Ziel-RNA geführt und schneidet diese. Vor der CasRx-Sequenz platzierten die Forscher einen synthetisch hergestellten Promotor, der aktiviert wird, wenn der SCPTS-Komplex an ihn bindet. Leitet man also SCPTS mit der entsprechenden sgRNA zum CasRx-Promotor, wird CasRx exprimiert und kann mithilfe einer zweiten sgRNA ein beliebiges Gentranskript der Wirtszelle ansteuern und herunterregeln. Das SCPTS-CasRx-System aktiviert oder inhibiert Transkripte quasi auf Knopfdruck – falls gewünscht, auch beides gleichzeitig.
Legnini erläutert: „Wir können im Prinzip beliebig viele sgRNAs co-transfizieren. Daher sind alle erdenklichen Kombinationen möglich. Wir könnten zum Beispiel ein wichtiges Protein der Embryonalentwicklung aktivieren und einen seiner Interaktionspartner gleichzeitig wegnehmen, um die Folgen zu sehen.“
Das klingt fabelhaft, doch wie effizient ist der CasRx-vermittelte Knock-down? Meist hängt die Knock-down-Effizienz stark von der Zielsequenz ab. Legnini und Co. testeten ihre SCPTS-CasRx-Methode mit verschiedenen zelleigenen RNAs. Das Team fand 45 Prozent weniger mRNA-Moleküle des Transkriptionsfaktors STAT3 und sogar 71 Prozent weniger Kopien der zirkulären RNA CDR1as, jeweils gemessen nach 24 Stunden Blaulichtbestrahlung. Beachtliche Werte, die auch in den Kontrollexperimenten mit dauerhaftem Lichteinfall nicht übertroffen wurden.
Das induzierbare SCPTS-CasRx-System mit Aktivierung und Knock-down funktionierte also wie gewünscht. Doch es fehlte die präzise räumliche Steuerung. Um hierfür den richtigen Versuchsaufbau zu finden, spielte die Gruppe verschiedene Ansätze durch. „Zuerst arbeiteten wir mit herkömmlichen Blenden“ berichtet Legnini. „Das war nichts anderes als schwarze Plastikfolie mit einer Aussparung, durch die dann Blaulicht auf die Probe scheint. Eine simple Lösung, doch die Auflösung war letztlich eher unbefriedigend.“
Für eine bessere Auflösung wechselten die Wissenschaftler an ein konfokales Mikroskop. „Im Gegensatz zu den LEDs erlaubt ein konfokaler Laser die punktgenaue Anregung einzelner Zellen. Und tatsächlich konnten wir die CasRx-Aktivität in einzelnen Zellen präzise anschalten, sowohl in klassischen als auch in dreidimensionalen Zellkulturen.“
Jetzt waren die Berliner so weit, ihr System einem echten Härtetest zu unterziehen. Denn die meisten Versuche liefen in zweidimensionalen Zellkulturen ab – weit weg also von Organen, ganz zu schweigen von komplexen Organismen. Außerdem stellte sich die Frage, ob tatsächlich messbare Effekte in einem vielzelligen Gewebe auftreten würden, wenn die Forscher die RNA-Level in einzelnen Zellen manipulierten.
Antworten hierauf sollten Experimente mit Organoiden liefern. Organoide sind kompakte, bis zu einigen Millimetern große kultivierte Zellverbände, die Organe nachahmen sollen. Keimzelle sind meist Stammzellen, etwa humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs). Aus diesen entstehen unter geeigneten Kultur- und Differenzierungsbedingungen abgeschlossene Gewebestrukturen, die echten Organen in vielen Eigenschaften ähneln.
Welchen Organtyp die kleinen Zellklumpen nachahmen, lässt sich mit Transkriptionsfaktoren steuern. Die von Legnini und seinen Kollegen kultivierten Organoide dienten als Modell für die räumliche Verteilung im kaudalen Part des Neuralrohrs, also dem Vorläufer des Zentralnervensystems. Ziel war, die Expression des Proteins Sonic Hedgehog (SHH) in den Organoiden punktgenau zu manipulieren. SHH ist ein Schlüsselmolekül in der frühen Embryogenese, das graduell im Gewebe verteilt ist und als Morphogen die Organogenese steuert. Kleinste Veränderungen des SHH-Gradienten können große Auswirkungen auf das Schicksal ganzer Zellverbände haben.
Mit einem Blaulichtlaser induzierten die Wissenschaftler die SHH-Expression an einem Pol der Organoide. Fünf Tage später verglichen sie immunhistologisch die Expressionsmuster in belichteten und unbelichteten Organoiden. Die Ergebnisse waren sehr deutlich. „Die Organoide exprimierten SHH-abhängige Faktoren wie FOXA2, OLIG2 und NKX6-1 in einem charakteristischen räumlichen Muster, das der Verteilung im kaudalen Neuralrohr sehr nahekommt“, erläutert Legnini. „Auslöser dafür ist die SHH-Expression in einigen wenigen Zellen am Organoidpol, die wir raum- und zeitspezifisch hervorgerufen haben. Wir lenkten also mit einer lokalen Manipulation die organtypische Entwicklung im gesamten Gewebe. Das ist wirklich cool und in meinen Augen der Höhepunkt der Studie.“
Zu guter Letzt führte das Team räumliche Transkriptom-Analysen mit hiPSC-Zellkulturen durch. Zu diesem Zweck belichtete es zunächst das Zentrum einer Stammzellkultur, um SHH zu exprimieren. Danach überführten die Wissenschaftler die hiPSC-Kultur samt Untergrund auf eine speziell präparierte Glasplatte für die Analyse der räumlichen Genexpression (Visium System der Firma 10X Genomics). Das Visium-Glas ist mit unzähligen kurzen Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Basenfolgen beschichtet, die komplementäre RNA-Moleküle aus der Zellkultur binden können. Hierdurch lässt sich ermitteln, wie oft einzelne Transkripte in dieser vorkommen. Jedes Oligonukleotid ist zusätzlich mit einem Barcode versehen, um die detektierten RNA-Moleküle an ihren Ursprungsort zurückverfolgen zu können. Mit dieser In-situ-capture-Technik fand das Team heraus, dass in den Zellen nahe der Belichtungsstelle dutzende SHH-assoziierte Gene hochreguliert waren – aber nicht in der Peripherie. Die Expression nicht-SHH-assoziierter Gene war unverändert. Legnini bemerkt hierzu: „Unser Visium-Versuch sollte demonstrieren, dass wir das punktgenaue Anschalten eines Gens mit modernen Methoden der räumlichen Transkriptomik verbinden können. Das ist uns definitiv gelungen.“
Neuartige molekulargenetische Techniken, moderne Transkriptom-Analysen und neurale Organoide – in dem Preprint der Berliner steckt eine geballte Ladung methodischen Know-hows. Dabei wurde ein wichtiger Aspekt der Studie der Übersichtlichkeit zuliebe noch gar nicht erwähnt: Das CRISPR-basierte SCPTS-CasRx-Doppelsystem ist nur eines von drei Werkzeugen, die Rajewskys Gruppe zur RNA-Manipulation weiterentwickelte. Zwei weitere Licht-induzierbare Verfahren basieren auf einem Cre-LoxP-System beziehungsweise nutzen die Tetracyclin-Aktivierung. Die Versuche der Gruppe mit dem Visium-System zur Transkriptomik sowie in den Organoiden erfolgten beispielsweise parallel in SCPTS- und Cre-LoxP-Transkriptionssystem.
Doch warum die doppelte Arbeit? „All diese Systeme haben Vor- und Nachteile“, erklärt Legnini. „Es kann zum Beispiel sein, dass sich für ein Gen partout keine gute sgRNA designen lässt. Dann läuft SCPTS ins Leere, da dCas9 nicht binden kann. Mit dem Cre-LoxP-System kann man dieses Gen ohne Probleme stabil mit einem passgenauen Promotor ins Wirtsgenom integrieren. Dafür birgt das SCPTS-CasRx-System riesiges Potenzial, wenn man mehrere sgRNAs für unterschiedliche Zielgene zur gleichen Zeit einsetzen will. Anders ausgedrückt: Jeder Anwender kann sich das Werkzeug aussuchen, das für seine Fragestellung am besten passt.“
Legnini betont bei alldem die enge Zusammenarbeit mit anderen Gruppen des BIMSB. Ohne deren Expertise und Zusammenarbeit hätte vieles nicht in diesem Umfang realisiert werden können.
Wie bei jeder guten Geschichte ist auch bei dieser das Ende offen. Wie könnte sie weitergehen? Rajewskys Team arbeitet daran, in den Organoiden das CasRx-Modul für Knock-downs zu nutzen. Je nachdem, wie die Experimente laufen, sollen die Daten noch in das aktuelle bioRxiv-Manuskript einfließen oder separat veröffentlicht werden.
Und sonst? Haben die Organoide nicht Lust auf mehr gemacht? Stichwort Mausmodell. Legnini lacht kurz und antwortet dann salomonisch: „Ich gebe unsere Methoden liebend gerne anderen Forschern an die Hand, natürlich auch für Anwendungen im lebenden Tier. Da ist ja mit optogenetischen Methoden schon viel erreicht worden in jüngster Zeit. Doch ich persönlich bleibe den Organoiden treu, da fühle ich mich einfach wohler.“
Sicher keine schlechte Idee.