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Zukunftsfähiges Zellkulturmedium - Zellkultur mit Plättchenlysat

Hatim Hemeda


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(10.12.2021) Ergebnisse aus der Grundlagenforschung in die Therapie zu übertragen, ist angesichts der rasanten Entwicklung in der regenerativen Medizin nicht immer einfach. Zellkulturlabore sollten deshalb bei der Etablierung von Protokollen heute schon an morgen denken und Nährmedien für die Zellkultur mit Bedacht wählen.

Zellkulturen sind in der Zell- und Molekularbiologie unverzichtbar, etwa um zelluläre Prozesse zu erforschen, Impfstoffe, Pharmazeutika, therapeutische Proteine und Antikörper zu entwickeln und herzustellen sowie um neuartige Therapien zum Beispiel mit Stammzellen zu etablieren.

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Aus recycelten Thrombozyten-Konzentraten gewonnenes Humanes Plättchenlysat kann in Zellkulturmedien Kälberserum ersetzen. Foto: University of Utah

Damit sich die Zellen im Labor wohl fühlen, werden sie in Medien kultiviert, die den zellulären Stoffwechsel fördern und physiologische Zellprozesse auch außerhalb des Ausgangsorganismus aufrechterhalten. Das Fundament bilden sogenannte Basalmedien, die grundlegende Nährstoffe bereitstellen, wie zum Beispiel Aminosäuren, Nukleotide, Salze und Vitamine. Die Zugabe eines Zellkultur-Supplements, das insbesondere Wachstumsfaktoren liefert, vervollständigt das Nährmedium.

Die Auswahl des geeigneten Zellkulturzusatzes hängt von der Anwendung und den verwendeten Zelltypen ab. Aktuell bieten die einschlägigen Hersteller im Wesentlichen drei Zellkultur-Supplemente an: Fetales Kälberserum (FKS) beziehungsweise Fetal Bovine Serum (FBS), chemisch definierte Zellkulturmedien sowie Humanes Plättchenlysat (HPL).

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Seit es 1958 in der Zellkultur eingeführt wurde, hat sich Fetales Kälberserum, das viele wachstumsfördernde Komponenten enthält, zum „Goldstandard“ der Medienzusätze entwickelt. Das Serum wird jedoch aus dem Blut ungeborener Kälber gewonnen und widerspricht den heutigen Ansprüchen an Ethik und Nachhaltigkeit. Auch die Herstellungspraxis steht in der Kritik: In der EU verboten, wird das Verfahren zur Gewinnung des Serums seit Jahren ins Ausland verlagert. Die Prozedur findet in Schlachthöfen statt, fernab GMP-konformer und standardisierter Prozesse. In der Praxis führt dies in Zellkulturlaboren zu aufwendigen Chargenprüfungen sowie Platzmangel in den Tiefkühlschränken. Wird eine Charge für gut befunden, lagert man in der Regel gleich einen ganzen Jahresvorrat ein. Nur so stellt man Verfügbarkeit und Preis der Charge sicher – und damit auch die Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse.

Für klinische und therapeutische Studien, etwa mit Stammzellen, ist FBS aufgrund von Sicherheitsrisiken meist ungeeignet. Zu den größten Gefahren zählen die potenzielle Übertragung von Prionenerkrankungen, Zoonosen sowie xenogene Proteine, die eine nachteilige Immunantwort beim Patienten hervorrufen können.

Seit einem Jahrzehnt nehmen die Bestrebungen zu, Alternativen zu tierischen Seren zu finden. Ein möglicher Weg sind chemisch definierte Medien, die aus synthetisch hergestellten Komponenten in exakten Konzentrationen zusammengesetzt sind. Je nach Bedarf und Zelltyp wird eine eigene Rezeptur mit spezifischen essenziellen Faktoren, zum Beispiel Wachstumsfaktoren entwickelt. Die größere Sicherheit der synthetischen Komponenten ist jedoch mit einem erhöhten Aufwand verbunden: Protokolle zur Zusammensetzung müssen in den Laboren individuell erarbeitet und erprobt werden, weil die Medien aus zahlreichen Einzelkomponenten bestehen. Da die Auswahl vorgefertigter synthetischer Medien aktuell begrenzt ist und diese häufig patentrechtlich geschützt werden, sind die Preise sehr hoch und für viele Forscher nicht erschwinglich.

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Eine Brücke zwischen der Sicherheit und Reproduzierbarkeit chemisch definierter Medien und dem proteinreichen FBS schlägt das humane „Recyclingprodukt“ HPL. Humanes Plättchenlysat auf Basis ungenutzter Blutkonserven ist eine effiziente, ethisch vertretbare und nachhaltige Alternative. Es wird aus Thrombozyten-Konzentraten produziert, die in der Transfusionsmedizin übrig bleiben und nachweislich auf Viren getestet und zu Transfusionszwecken freigegeben wurden.

Aber warum eigentlich Thrombozyten? Thrombozyten (Blutplättchen) spielen eine zentrale Rolle bei der Blutgerinnung: Schneiden wir uns in den Finger, kommt es zur Blutung, die eine Kettenreaktion der beteiligten Faktoren aktiviert. Thrombozyten heften sich an die Wunde und bilden mit den Gerinnungsfaktoren eine Blutkruste, die die Wunde verschließt. Die einsetzende Wundheilung wird durch Wachstumsfaktoren initiiert, die von den Thrombozyten ausgeschüttet werden.

Diese Wachstumsfaktoren werden während des Herstellungsprozesses von HPL extrahiert. Das Endprodukt ist ein Lysat, das viele Wachstumsfaktoren und Zytokine enthält, die die Zellproliferation stimulieren sowie den Phänotyp und das Differenzierungspotenzial der Zellen erhalten. Das Plättchenlysat fördert das Zellwachstum und ist zudem Grundlage für aussichtsreiche Therapieansätze in der Humanmedizin.

HPL ist eine sichere und wissenschaftlich geprüfte Alternative, die für viele humane und tierische Primärzellen sowie Zelllinien geeignet ist, für die bisher FBS verwendet wurde. In der akademischen Forschung ist FBS deshalb in vielen Zellkultur-Experimenten durch HPL ersetzbar. Sowohl die Qualität des Zellwachstums als auch die Performance der mit HPL kultivierten Zellverbände sind vergleichbar oder besser als mit FBS. So veröffentlichte zum Beispiel Jürgen Grolls Gruppe von der Universität Würzburg in Scientific Reports Ergebnisse zur Verträglichkeit von Biomaterialien (9: 3533). Bei der Anzucht der hierfür erforderlichen Makrophagen und mesenchymalen Stammzellen (MSC) in verschiedenen Nährmedien schnitt HPL besser ab als FBS.

Fabian Westhausers Team an der Universität Heidelberg belegte 2020 den positiven Einfluss von HPL auf die Zellproliferation mesenchymaler Stammzellen – mit HPL erzielte die Gruppe eine doppelt so schnelle Proliferationsrate als mit FBS (Cells 9: 918).

Ein in diesem Jahr im Journal of Diabetes & Metabolic Disorders veröffentlichter Vorbericht zu einer nicht-randomisierten klinischen Studie (Phase 1) enthält ein GMP-konformes Protokoll auf Basis von HPL. Die iranische Gruppe erprobte auf Grundlage des Protokolls die Sicherheit und Effizienz der Stammzelltransplantation an Diabetes-Mellitus-Typ-1-Patienten als Alternative zur Insulintherapie. Die kurzfristige Sicherheit wurde im Anschluss an die einjährige Beobachtung der Patienten belegt, für den Nachweis der Langzeitsicherheit werden noch weitere Untersuchungen benötigt (J. Diabetes Metab. Disord., doi: org/10.1007/s40200-021-00837-9).

Gleichmäßige Qualität

Aufgrund der Homogenität von HPL sind keine ständigen Überprüfungen der Chargen notwendig (J. Stem Cells Res. Rev. & Rep. 2(1): 1021; Biomaterials 76: 371-87). Durch große Pools von Thrombozyten-Konzentraten ist die Chargenkonsistenz sichergestellt und damit auch die Reproduzierbarkeit von Studienergebnissen. Der Wechsel von FBS zu HPL ist unkompliziert und erfordert keine besondere Anpassung der Arbeitsschritte. Werden die im HPL vorkommenden Gerinnungsfaktoren (Fibrinogene) während des Produktionsprozesses nicht entfernt, kann eine Gerinnung im fertigen Medium durch Zugabe von Antikoagulanzien, zum Beispiel Heparin, vermieden werden, die man dem Basalmedium zusammen mit HPL beimischt. Zudem sind Fibrinogen-depletierte HPL-Varianten ohne Gerinnungsfaktoren erhältlich.

Bei tierischen Zellen kann eine sequenzielle Adaption der Zellen an das neue Supplement notwendig sein. Dieser Vorgang ist nach ein bis zwei Passagen abgeschlossen. Humane Zellen vertragen in der Regel einen direkten Wechsel zu HPL. Bei diesem gilt es, die optimale Konzentration beziehungsweise den optimalen Anteil des Humanen Plättchenlysats im Gesamtmedium zu finden. Je nach Zelle und Anwendung reicht eine Konzentration ab 2,5 bis 10 Prozent (v/v) aus, um vergleichbare Ergebnisse wie mit 10 Prozent (v/v) FBS zu erzielen. Ist die optimale Konzentration ermittelt, lässt sich der Zellkulturprozess nahtlos fortführen.

Speziell für Stammzellen

Ist die zwei- oder dreidimensionale Zellkultur auf HPL umgestellt, reichen die Einsatzmöglichkeiten vom Proof-of-Concept bis hin zur Stammzelltherapie. Da das humane Ausgangsmaterial von HPL zur Transfusion freigegeben ist, eignet sich HPL besonders gut für die Stammzellkultivierung. Mit HPL sind sowohl Zellen als auch Medium humanen Ursprungs, wodurch ein nahtloser Transfer von Forschungsergebnissen in die Therapie möglich ist – die Zellen können von der Grundlagenforschung bis zur Stammzelltherapie im gleichen Medium kultiviert werden.

Für die Grundlagenforschung existieren kostengünstige HPL-Produkte, für die Translation in die Klinik ist HPL gemäß GMP erhältlich. Forschungsinstitute wie das Karolinska-Institut in Schweden setzen für verschiedene klinische Studien mit MSC seit Jahren auf HPL. Ebenso produziert die plastische Chirurgie des Rigshospitalet in Kopenhagen Stammzellen mithilfe von HPL zu Transplantationszwecken, um Gewebe zu rekonstruieren. Ergebnisse dieser randomisierten kontrollierten klinischen Studie wurden 2020 publiziert (Stem Cells Transl. Med. 9(11): 1277-86).

Junge Forscher haben bereits heute die Möglichkeit, HPL einzusetzen und so von Anfang an einen Beitrag zu nachhaltiger Forschung zu leisten. Nachhaltig nicht nur im Hinblick auf unsere Umwelt und das Tierwohl, sondern auch mit Blick auf die langfristige und lückenlose Verwendbarkeit der Studienergebnisse.



Hatim Hemeda entwickelte in Wolfgang Wagners Gruppe an der Uniklinik RWTH Aachen neue Methoden zur automatischen Isolierung von Stammzellen und untersuchte die Eignung von Humanem Plättchenlysat (HPL) für die Kultur mesenchymaler Stromazellen. 2015 gründete er die Biotech-Firma PL BioScience, die HPL herstellt.