Wo ist das Gen?

Genkartierung

Petra Neis-Beeckmann

Kartieren kommt von Karte, und auf Karten sind Orte verzeichnet, zu denen man gelangen will. Das kann auf mehreren Routen geschehen. Der Weg zum Genort gestaltet sich jedoch auf Chromosomen meistens schwierig.

Voraussetzung für das Gene finden ist eine Genkarte. Die erstellen Sie sich selber (mühsam!) oder Sie ordnen den unbekannten Ort in eine bereits erstellte Genkarte ein (weniger mühsam). Es gibt genetische und physikalische Kartierungsverfahren.


Wer mit wem?

Bei der genetischen Kartierung ermittelt man relative Abstände zwischen Genorten. Die dafür verwendete Technik heißt Kopplungsanalyse. Die erste Karte, die auf diese Weise erstellt wurde, gründet auf den Versuchen Thomas Morgans an Drosophila melanogaster. Bereits im Jahr 1911 hatte Morgans Arbeitsgruppe an der Columbia-University in New York festgestellt, dass bestimmte Merkmale immer gekoppelt auftraten. Manchmal allerdings kam es zu einer neuen Anordnung (Rekombination).

Wie oft zwei Loci rekombinieren, ihre Rekombinationsfrequenz, hängt von ihrer Entfernung ab. Auf diese Weise konnte Morgan fünf geschlechtsgekoppelte Faktoren kartieren. Zu Ehren Morgans ist eine Rekombinationsfrequenz von einem Prozent als ein centiMorgan (cM) definiert worden. cM ist die Maßeinheit aller genetischen Karten.

Heutzutage sucht man sich bei genetischen Kartierungen mehrere Orte auf einer bestehenden Karte, deren Positionen man mit Sicherheit bestimmt hat (framework map). Neue Loci ordnet man dieser Karte zu, indem man die Rekombinationen zwischen den neuen und den bereits platzierten Loci analysiert.

Die Abstände zwischen Genorten werden mit der Lod Score-Methode berechnet. Der Lod Score ist der Logarithmus des Quotienten aus der Kopplungs-Wahrscheinlichkeit geteilt durch die Wahrscheinlichkeit einer Nicht-Kopplung. Man muss jedoch kein Mathematiker sein, um genetisch zu kartieren. Es gibt Computerprogramme, die alle nötigen Parameter berechnen (zum Beispiel "Locusmap" oder "CRIMAP"). Die neuesten Versionen dieser Programme kann man sich von den Genomforschungsprogrammen im Internet kostenlos herunterladen. Kartierungsfunktionen rechnen die Rekombinationsfrequenz, die man im Labor gemessen hat, in cM um. Die gebräuchlichsten sind die Funktionen von Haldane, Morgan oder Kosambi.

Vorsicht: Achten Sie beim Vergleich von Genkarten auf die verwendete Kartierungsfunktion! Die Unterschiede zwischen den Funktionen, also z.B. zwischen Kosambi cM und Haldane cM, sind zwar oft minimal, könnten aber in einem positionellen Klonierungsprojekt den entscheidenden letzten Schritt zum Gen erschweren.

Frauen tun es öfter

Genetisches Material rekombiniert in der Meiose verschieden oft. Dies hängt von Alter und Geschlecht des untersuchten Individuums ab oder von Länge und Region eines Chromosoms. Oft werden deshalb für die Geschlechter getrennte genetische Karten erstellt. In einer geschlechtsneutralen Karte werden die Werte dann gemittelt. In der Regel rekombinieren die Chromosomen von Säugerweibchen häufiger als die der Männchen. Bei Frauen kann der Abstand zwischen zwei Genen also wesentlich länger sein als bei Männern. Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass genetische Karten relativ sind; man betrachtet Genorte nur im Verhältnis zu einander.

Alles in einem Topf

Voraussetzung für eine statistische Absicherung der genetischen Kartierung sind möglichst viele DNA-Proben (idealerweise mehrere hundert). Dies kommt allerdings teuer. Eine Alternative ist die 1991 von Michelmore et al. (Proc Natl Acad Sci 88(21) 9828-32) entwickelte Bulk-Segregant-Analyse, bei der DNAs mehrerer Individuen gepoolt werden und dann zum Beispiel ein Wildtyp-Pool (oder -Bulk) mit dem zugehörigen Mutanten-Pool an definierten Fixpunkten im Genom verglichen wird.

Eine weitere Möglichkeit ist die Multiplex-PCR, bei der man innerhalb eines Ansatzes mehrere Fragmente vervielfacht. Die PCR-Produkte werden dann durch Farbstoffe unterschieden, oder sie lassen sich eindeutig in ihrer Produktlänge abgrenzen. Multiplex-PCRs haben den Nachteil, dass bestimmte Fragmente bevorzugt vervielfältigt werden. Hinzu kommt, dass es Zeit kostet, alle Konzentrationen optimal aufeinander abzustimmen. Für immer wiederkehrende Untersuchungen - beispielsweise in der Diagnostik - lohnt sich der Aufwand. Sonst sollte man abwägen - nämlich Genauigkeit gegen Schnelligkeit. Oft erkennt man Probleme erst spät, zum Beispiel, wenn die Unterschiede der Fragmentlängen der Allele nur einige Basenpaaren betragen.

Die Bulk-Segregant-Analyse kann dagegen in hohem Durchsatz - etwa im 96-Well-Format - durchgeführt werden. Sie können das Probenmaterial einzeln in das jeweilige Well geben und dort auch direkt lysieren. Danach poolen Sie die Lysate und bearbeiten den Pool mit einem DNA-Extraktions-Kit. So müssen Sie zum Schluss nur wenige Pool-Proben untersuchen. Auch die DNA-Ausbeute ist herzerfreuend und reicht für zahlreiche Genomescans, also "Expeditionen" durchs Genom.


Oft reicht das bloße Auge...

Das zugrunde liegende Kreuzungsschema soll es Ihnen erlauben, bestimmte Chromosomenabschnitte durch die Generationen zu verfolgen. Als Marker für diese Chromosomen-Abschnitte bieten sich repetitive Sequenzen an (beispielsweise Mikrosatelliten) oder auch Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). DNA-Repeats können durch PCR und anschließende elektrophoretische Auftrennung analysiert werden. Ausgewertet werden die Fragmentmuster mit Auswertungsprogrammen. Die bieten aber meist so viele Optionen, dass es unübersichtlich wird. Die meisten Ergebnisse von Fragmentanalysen sind mit erfahrenem Auge auch manuell auszuwerten.

Eine große Auswahl an bereits kartierten, polymorphen Sequenzen ist für viele Spezies im Internet zu finden (z.B. animalgenome.org; zebrafish.mgh.harvard.edu; ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human). Hier werden meist detaillierte Informationen über Position, Primersequenzen, Polymorphismus, Allelgrößen etc. angeboten. Bei der Auswahl sollten Sie gleich mehrere Primerpaare pro Kartenposition testen. Für die Untersuchungen suchen Sie sich dann den Locus aus, der am informativsten ist, bei dem die PCR am besten klappt, und der die schönsten Banden liefert.


...aber Achtgeben sollte man schon

Genetische Kartierung erfordert eine akribische Arbeitsweise, da sich schon wenige Fehler - ob im Labor oder bei der Auswertung am Schreibtisch - übel auswirken. Durch solche Fehler werden nämlich Abstände zwischen Loci viel länger als sie in Wirklichkeit sind. Und im Extremfall errechnet man komplett falsche Positionen, das heißt, man bringt die Abfolge der Loci durcheinander. Deshalb empfehle ich, sich und seine Geräte während des Experiments häufig zu kontrollieren, zum Beispiel durch Wiederholungsuntersuchungen mit gezielten Stichproben. Hat sich nämlich ein Fehler eingeschlichen, so braucht es viel Geduld, um die falsch typisierte Probe in der Fülle von Daten und Auswertungen zu finden. Die Fehlerquelle plätschert auch sonst reichlich: etwa wenn das Enzym beim Kopieren der Repeats in der PCR den Anfang nicht findet, weil zwanzigmal CACACA... hintereinander auch für Polymerasen gleich aussehen (Slippage-Effekt).

Beim Menschen stehen weder große Probenzahlen noch definierte Kreuzungsschemata zur Verfügung. Der Weg zum Gen ist nur mit physikalischen Kartierungsmethoden zu finden. Warum dann überhaupt genetisch kartieren? Weil diese Verfahren die Möglichkeit bieten, einen unbekannten Genort erst einmal grob einzuordnen. Schon die Zuordnung zu einem bestimmten Chromosom kann hilfreich sein.

Eine Erweiterung der genetischen Kartierung ist die QTL-Kartierung (Quantitative Trait Loci). Viele Merkmale, eben die QTLs, werden nämlich durch mehrere Gene und die Umwelt bestimmt. Das gilt auch für eine große Zahl genetisch bedingter Krankheiten. QTLs zeigen eine schwer zu durchschauende Vererbungsweise, die den Kartierungsgenetiker zu aufwändigen statistischen Analysen zwingt.


Bis zur letzten Base

Bei den physikalischen Kartierungsverfahren werden Genorte direkt dem DNA-Molekül zugeordnet. Die Abstände werden in Basenpaaren angegeben. Im Gegensatz zur genetischen Kartierung werden diese Verfahren nur von Mutationen beeinflusst, die auf Linearität und Länge wirken. Ein weiterer Vorteil dieser Kartierungsmethoden liegt darin, vergleichend zwischen Spezies kartieren zu können (z.B. Mensch-Maus).

Zu den gängigsten physikalischen Kartierungsmethoden gehört seit den 60ern die In-situ-Hybridisierung. Bei dieser Technik werden spezifische, mittlerweile fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden gegen Metaphasechromosomen hybridisiert (FISH). Das Signal kann noch immunologisch verstärkt werden. Weitere Verfahren sind das Radiation Hybrid (RH) -Mapping, Mikromanipulationstechniken oder die Herstellung von DNA-Bibliotheken.

Die DNA-Sequenzierung bestimmt endlich die lineare Nukleotidfolge und damit die endgültige physikalische Karte. Für welche der Methoden Sie sich auch entscheiden: Gute Reise!

Letzte Änderungen: 06.09.2005