Statt die eigene Reaktionsmischung für die qPCR herzustellen, ordern viele kommerzielle Mastermixe.
Die Zutaten für vorgefertigte Mastermixe sind immer die gleichen: eine hitzestabile Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate (DNTPs), ein wenig MgCl2 und eine Pufferlösung, in der das Ganze gelöst ist.
Soll die Detektion des PCR-Produktes mit einem interkalierenden Farbstoff erfolgen, wählt man einen Mastermix der bereits einen Farbstoff enthält. Wer die gebildeten Amplikons lieber mit TaqMan- oder anderen Proben nachweist, findet auch hierzu entsprechend vorbereitete Mischungen und Kits. Häufig enthalten diese zusätzlich noch dUTP und eine hitzeempfindliche Uracil-DNA-Glycosylase (UDG, UNG). Diese entfernt die von der Polymerase in die DNA-Moleküle eingebauten Uracil-Reste. Erhitzt man den Reaktionsansatz brechen die DNA-Stränge an den Stellen, an denen die Uracil-Reste fehlen; gleichzeitig setzt man hierdurch die Uracil-DNA-Glycosylase außer Gefecht. Startet man anschließend die qPCR, kann man zumindest sicher sein, dass der Reaktionsansatz nicht bereits durch PCR-Produkte verunreinigt ist.
Eine Gewähr, dass man nicht durch andere Quellen Fremd-DNA in das Reaktionsgefäß einschleppt, hat man aber nicht. Ein Risikofaktor hierfür sind Mastermixe und man muss nicht lange in der Literatur stöbern, um auf entsprechende Fälle zu stoßen. So staunte zum Beispiel eine Gruppe um den Londoner Virologen Richard Tedder nicht schlecht, als sie bei der Suche nach dem Maus-Retrovirus XMRV mit der qPCR, auch in Kontrollen fündig wurden, die Wasser statt cDNA enthielten (Tuke et al., 2011, PLoS ONE 6(5): e19953 doi:10.1371/journal.pone.0019953). Da die Experimentatoren das Wasser als Kontaminations-Quelle ausschließen konnten, gingen sie davon aus, dass der verwendete Mastermix mit Maus-DNA verunreinigt war. Was durchaus nahelag, denn das englische Team setzte einen Mastermix mit einer Hot-Start-Polymerase ein. Bei diesem hält ein Mausantikörper die Taq davon ab, schon bei Raumtemperatur mit der Verlängerung der Primer loszulegen.
Auch einen weiteren Punkt sollte man nicht außer Acht lassen: die Effektivität oder neudeutsch, Performance, von qPCR-Mastermixen variiert beträchtlich. Christiane Frahms Gruppe vom Universitätsklinikum Jena machte sich die Mühe und setzte 12 kommerzielle qPCR-Kits und Mastermixe für die Reverse Transkriptase qPCR (RT-qPCR) mit Proben aus Maus, Ratte und Mensch ein. Anschließend quantifizierte das Team die relative Amplifikationseffizienz der einzelnen Kits, bezogen auf den Durchschnittswert aller zwölf Kits.
Hierbei traten beträchtliche Unterschiede zu Tage. So lag die niedrigste relative Effizienz bei 54 %, die höchste bei 171 %. Mit anderen Worten: der schlechteste Kit amplifizierte die DNA nur halb so effektiv wie ein durchschnittlicher und wesentlich schlechter als der effizienteste. Wer genau wissen will, wie sich die einzelnen Kits bei diesem Qualitätsmerkmal schlugen, sollte sich Figur 3A in Frahms Paper genauer ansehen, in der die Gruppe alle Kennzahlen der getesteten Kits und Mastermixe in einer Übersichtstafel zusammenfasst.
Aufgrund der signifikanten Unterschiede raten die Autoren, qPCR-Mastermixe auf ihre Stärken und Schwächen hin abzuklopfen und die qPCR-Protokolle entsprechend zu optimieren. Wenn man dann auch noch die DNA-Kontaminationen eliminiert, kann bei der qPCR mit Mastermixen nicht mehr viel schief gehen.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 01/2013, Stand: Januar 2013, alle Angaben ohne Gewähr)
