Spätestens wenn die fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusszelle des Durchflusszytometers ankommen, entscheidet sich, ob die Farbstoffkombination zusammenpasst.
Nicht nur Maler brauchen ein feines Gespür für Farben.
Was würden Lebenswissenschaftler bloß tun, wenn man ihnen ihre heißgeliebten Bausätze und Bastelanleitungen wegnehmen würde? Die Vorstellung von einem Labor ohne Kits und Manuals dürfte bei den meisten die gleiche Panik auslösen, wie bei den mit „d“ geschriebenen Kids der Gedanke an ein Leben ohne Handy. Ob Nukleinsäure-Extraktion, qualitative und quantitative PCR, Proteinreinigung, RNAi oder Immunopräzipitation – kein Forscher will auf seinen liebgewonnenen Kit verzichten.
Dies gilt zunehmend auch für die Durchflusszytometrie. Bis vor wenigen Jahren war diese noch eine Domäne von erfahrenen Spezialisten und Serviceabteilungen. Dank preiswerter und einfach(er) zu bedienender Tischgeräte und einer stetig wachsenden Zahl von Durchflusszytometrie-Kits trauen sich aber auch immer mehr „Laien“ an die Arbeit mit den empfindlichen Geräten, die sich manchmal wie zickige Diven verhalten.
Inzwischen decken Durchflusszytometrie-Kits das komplette Anwendungsspektrum der Durchflusszytometrie ab, das von der klassischen Zellzahl und Vitalitätsbestimmung über Immunophenotypisierung, Apoptosenachweis, Signalwegforschung, Cytokinbestimmung bis zur Mehrfarbenanalyse von Neuromarkern reicht. Sie enthalten zumeist aber nichts, was der Forscher auch selbst herstellen oder zusammenmischen könnte: im Wesentlichen sind dies ein Satz Farbstoff-konjugierter Antikörper, ein auf den jeweiligen Zellassay zugeschnittener Puffer und Kontrollen.
Ziemlich simple Zutaten könnte man annehmen, aber wie so oft in den Lebenswissenschaften, steckt der Teufel im Detail oder konkreter in der Wahl der Farbstoffe, mit denen die Antikörper konjugiert sind.
Will man nur ein oder zwei Antigene, etwa die Oberflächenproteine CD4 und CD8 von T-Lymphozyten, mit einem Fluoreszenz-Antikörper für die Durchflusszytometrie markieren, ist dies kein großes Hexenwerk. Hier muss lediglich das Anregungs- und Emmissionsspektrum des Farbstoffs zur Wellenlänge des Lasers beziehungsweise zum für die Detektion verwendeten Fluoreszenz-Kanal des Durchflusszytometers passen.
Kompliziert wird die Auswahl dagegen bei Mehrfarben, beziehungsweise Multiparameter-Analysen, bei denen das Durchflusszytometer mehr als zwei fluoreszenzmarkierte Antigene auseinander dividieren muss. Wer hier die Farbpalette, im Durchflusszytometrie-Sprech das „Farbpanel“, so zusammenstellt, dass sich die einzelnen Emissionsspektren zu sehr ins Gehege kommen, wird nur Hausnummern messen.
Tatsächlich ist die Fülle der angebotenen Farbstoffe für Nichtexperten und Dummies wie den Laborjournal-Reporter kaum noch zu überblicken. Längst vorbei sind die Zeiten, als man sich noch mit den vier Farbstoff-Klassikern Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC) begnügte. Zu diesen gesellten sich in den neunziger Jahren zunächst Tandem-Farbstoffe, bei denen PE einen zweiten organischen oder inorganischen Farbstoff, etwa Texas-Rot oder Cy7, huckepack trägt. Die von PE absorbierte Anregungsenergie wird hierbei nach dem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Prinzip auf den zweiten Farbstoff übertragen.
Ende der neunziger Jahre kamen zu diesen APC-basierte Tandemfarbstoffe und etwas später die große Palette der organischen Alexa-Farbstoffe hinzu. Anfang des neuen Milleniums machten schließlich so genannte Quantum Dots Furore, bevor im letzten Jahr mit Brilliant Violett die jüngste Entwicklung aus den Farbstoff-Laboren auftauchte.
Aus dieser riesigen Farbstoffpalette die richtigen herauszupicken und optimal auf die verwendeten Antikörper zu verteilen, ist gar nicht so einfach. Bereits bei einer Zehnfarben-Analyse, bei der zehn Antigene markiert werden sollen, ergeben sich Abermillionen Kombinationsmöglichkeiten für das Farbstoff-Panel.
Mit einigen einfachen Regeln lassen sich die Kombination aber zumindest etwas eingrenzen. So sollten sich die Emissionsspektren möglichst wenig überlappen, und Antikörper gegen selten vorkommende Antigene sollte man nicht unbedingt mit dem lichtschwächsten Fluoreszenz-Farbstoff mit der geringsten Quantenausbeute verknüpfen.
Die Gewissheit, ob das Farbenspiel harmoniert oder nicht, erhält man aber erst, wenn man das Panel ausprobiert – oder einen Kit benutzt, den der Hersteller bereits ausgiebig getestet hat. Zu finden sind diese auf den nächsten Seiten.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 03/2013, Stand: Februar 2013, alle Angaben ohne Gewähr)
