Letzter Schrei in Reportergen-Assays: die Luciferase der Garnele Oplophorus gracilirostris
Reportergene sind seit mehr als 30 Jahren in Zellen unterwegs, um Biowissenschaftlern vom Geschehen direkt vor Ort zu berichten.
Im Gegensatz zu Reportern aus Fleisch und Blut übermitteln Reportergene ihre Reportagen nicht mit Worten oder Bildern, sondern über Lichtsignale, die aus Farb-, Fluoreszenz- oder Lumineszenzreaktionen stammen.
Zu den beliebtesten und dienstältesten Reportergenen, beziehungsweise Reporterproteinen, zählt die schon 1985 klonierte Luciferase der amerikanischen Feuerfliege Photinus pyralis. Unzählige Reportergen Assay-Kits nutzen die durch die Luciferase der Feuerfliege katalysierte Oxydation des Substrates Luciferin zu Oxyluciferin. Neben AMP, Pyrophosphat und Kohlendioxid entsteht bei dieser auch ein kurzlebiger, gelb lumineszierender Lichtblitz.
Die Feuerfliegen-Luciferase drängt sich für Reportergen-Assays geradezu auf. Sie wird von Säugerzellen nicht exprimiert, und ihre Aktivität, die über eine große Enzymkonzentrations-Spanne linear verläuft, lässt sich mit einem Luminometer schon in geringsten Mengen nachweisen. Dennoch hat sie auch Nachteile.
Gianpaolo Rando, Post-doc am Centre of Integrative Genomics der Universität Lausanne, weist in seinem Blog Reportergene unter anderem darauf hin, dass Häm-Proteine das Lumineszenz-Signal abschwächen. Zudem gäbe es, so Rando, keine verlässlichen Hersteller-Angaben zur Luciferase-Aktivität. Nach seinen Erfahrungen variiert auch die Stabilität des Enzyms in unterschiedlichen Zell-Systemen sehr stark.
Wer nach Ersatz für die Feuerfliegen-Luciferase sucht, wird jedoch schnell fündig. Eine populäre Alternative, die teilweise auch in Kombination mit dieser in dualen Reportergen-Assays verwandt wird, ist die Luciferase der Weichkoralle Renilla reniformis. In Gegenwart von Sauerstoff setzt diese das Substrat Coelenterazin zu Coelentamid und Kohlendioxid um, woraus eine blaue Lumineszenz resultiert.
Mittlerweile muss alles, was kreucht, fleucht oder schwimmt und durch seine Lumineszenz auffällt, damit rechnen in einem Luciferase-Assay zu landen; ganz egal ob Tiefseefisch, Krebstierchen, Wurm, Dinoflagellat oder sonstiger Exot. Vor einigen Jahren erwischte es den Ruderfußkrebs Gaussia princeps, dessen Luciferase ein wesentlich stärkeres Lumineszenz-Signal erzeugt als Feuerfliegen- oder Renilla-Luciferasen. Hinzu kommt, dass die Gaussia-Luciferase in das Medium sekretiert wird, wodurch sich die Lysis der Zellen erübrigt.
Im letzten Jahr war schließlich die Tiefseegarnele Oplophorus gracilirostris an der Reihe, die sich mit einer lumineszierenden blauen Wolke gegen ihre Fressfeinde in den Untiefen der Ozeane wehrt. Für den Einsatz in Reportergen-Kits peppten die Assay-Entwickler die Oplophorus-Luciferase etwas auf. Da nur die kleine Untereinheit des tetrameren Proteins enzymatisch aktiv ist, klonierten sie nur diese und mutierten einen ihrer Aminosäurereste, um die Stabilität zu erhöhen. Anschließend optimierten sie durch Zufallsmutagenese und mit einem Screening in E. coli die Lumineszenz.
Wie Renilla- und Gaussia-Luciferase katalysiert auch die native Oplophorus-Luciferase die Oxidation von Coelenterazin zu Coelentamid. Die Forscher tüftelten so lange an der Grundstruktur von Coelenterazin, bis sie ein Substrat fanden, das ein 25mal stärkeres Lumineszenz-Signal erzeugt als Coelenterazin. Im Labor überzeugt die aufgemotzte Garnelen-Luciferase mit einer langen Halbwertszeit des Lichtsignals sowie einer hohen Enzymaktivität und Temperaturstabilität. Ein weiterer Vorteil ist ihre überschaubare Größe. Mit einem Molekulargewicht von 19 kDa ist sie wesentlich graziler als die dreimal so schwere Luciferase der Feuerfliege. Dadurch lässt sie sich zum einen einfacher in Reportergen-Konstrukte klonieren, zum anderen kommt sie in Fusionsproteinen den angehängten Proteinen weniger ins Gehege.
Lumineszente Reportergen-Assays dominieren inzwischen die klassischen Anwendungen von Reportergenen, etwa die Untersuchung von Promotoren, cis-regulierenden Elementen, Transkriptionsfaktoren oder von Signaltransduktionswegen. Biowissenschaftler verwenden Reportergene aber auch vermehrt für das molekulare Imaging von Kleintieren wie Mäusen oder Ratten, um zum Beispiel die Regulation von Genen oder Wechselwirkungen von Proteinen in vivo verfolgen zu können. Hierzu setzen sie zumeist fluoreszierende Reporter ein, etwa das Grün Fluoreszierende Protein (GFP), oder eine seiner zahlreichen, meist aus Riffkorallen isolierten Varianten, deren Farbspektrum von Azurblau bis Pflaumenrot reicht.
Ohne klassische Farb-, Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Reaktionen funktionieren sogenannte PET-Reportergene, die für die Visualisierung von Zellvorgängen mit der Positronen-Emmissions-Tomographie (PET) eingesetzt werden. Bei dieser erzeugt ein Zyklotron aus einem zuvor in die Zelle eingeschleusten Radionukleotid (PET-Probe) Positronen, die nach dem Zusammenprall mit einem Elektron, zwei Gammastrahlen aussenden. Eine PET-Kamera fängt diese ein und erzeugt ein Bild, das die Verteilung der Probe innerhalb einer Zelle oder eines Gewebes darstellt. Die von PET-Reportergenen kodierten Proteine, zumeist Enzyme, Rezeptoren oder Transporter, fungieren als PET-Proben, die sich in spezifischen Arealen der Zelle ansammeln und anhand der registrierten Gammastrahlung detektiert und quantifiziert werden.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2013, Stand: Oktober 2013, alle Angaben ohne Gewähr)
