Suboptimaler Western Blot.
Der Western Blot wehrt sich seit Ende der siebziger Jahre erfolgreich gegen alle alternativen Verfahren.
Ob Harry Towbin ahnte, dass der Western Blot, den er Ende der siebziger Jahre zusammen mit seinen Kollegen am Friedrich- Miescher-Institut in Basel austüftelte, auch 35 Jahre später noch zu den unentbehrlichen Methoden in biowissenschaftlichen Laboren gehören würde?
Towbin ist kürzlich von der ETH Zürich in den Ruhestand verabschiedet worden. Auch Neil Burnett, der unabhängig von Towbin an der amerikanischen Westküste an der gleichen Blotting-Methode arbeitete, die er als Western Blot bezeichnete, ist inzwischen pensioniert und spielt lieber Golf, als sich im Labor abzustrampeln.Die zwei Vorläufer des Western Blots, den Southern- und den Northern Blot, mit denen man ehemals DNA- beziehungsweise RNA auf eine Membran übertrug, kennen viele jüngere Biowissenschaftler nur noch vom Hörensagen oder aus Büchern.
Allein der Western Blot leistet noch immer hartnäckigen Widerstand gegen modernere Methoden und lässt sich partout nicht aus dem Labor vertreiben.
Towbin führte seinen Ur-Western Blot im Wet- oder Tankblot-Verfahren durch. Dazu stellte er das Blot-Sandwich aus Polyacrylamidgel, Nitrozellulose-Folie und Filterpapieren in einen mit 0,7 % Essigsäure gefüllten, damals gebräuchlichen elektrophoretischen Entfärbe-Apparat (Destainer). Anschließend schloss er Anode und Kathode des Destainers an ein Netzteil an. Die Spannung und die Stromstärke stellte er so ein, dass das elektrische Feld die Proteine ohne zu große Wärmeentwicklung aus dem Gel herauszog und auf die Membran beförderte. An diesem Tankblotverfahren hat sich auch 35 Jahre später nichts wesentliches geändert. Statt eines umgemodelten Destainers benutzt man heute eine schick gestylte Transferzelle mit Platten- oder Stabelektroden. Die Essigsäure wird meist durch einen Tris- oder Hydrogencarbonat-Puffer mit 20 % Methanol ersetzt. Ansonsten ist alles praktisch wie zu Towbins Zeiten. Die Proteine nehmen sich sehr viel Zeit für die Wanderung vom Gel auf die Blotmembran. Dafür schaffen es aber auch große Proteine auf die Blotfolie, die bei anderen Western Blot-Verfahren häufig nicht auf dieser ankommen.
Wie Southern- und Northern Blot kann man auch den Western Blot ganz ohne Strom und elektrisches Feld durchführen. Legt man einen Filterpapierstapel auf das puffergetränkte Gel, so transportieren die Kapillarkräfte des Papiers die Pufferflüssigkeit und die darin gelösten Proteine auf die Blotmembran. Zur großen Verblüffung des LJ-Reporters hat sich dieses sehr ursprüngliche Blotverfahren in das 21. Jahrhundert gerettet und wird zum Beispiel in Kombination mit speziellen Fertiggelen noch immer angewandt.
Die für dieses sogenannte Kontaktblotverfahren nötige Blotapparatur besteht aus einer mit niedrigen Seitenwänden eingerahmten Aufnahmeplatte, auf der man die in Puffer äquilibrierten Gele platziert. Wie üblich legt man zunächst die Membran auf das Gel und packt dann einen Stapel Blotpapier obendrauf. Anschließend presst man das Blotsandwich mit einer mit Schrauben fixierten und spannbaren Deckelplatte zusammen. Auch hier wandern die Proteine sehr gemächlich vom Gel auf die Blotmembran, ein paar Stunden sollte man in jedem Fall einplanen. Dafür verspricht der Hersteller jedoch astreine Blots.
Die am häufigsten in den Laboren anzutreffenden Blotting-Geräte dürften aber Semi-Dry-Blotter sein, die wie das Kontaktblot-Verfahren sehr wenig Pufferlösung benötigen. Beim Semi-Dry-Blotten spannt man das Blotsandwich zwischen zwei Graphitplatten ein und hilft den Proteinen mit einem kräftigen elektrischen Feld auf die Sprünge. Da der Abstand zwischen den beiden Graphitplatten sehr klein ist und das Filterpapier des Blotsandwiches direkten Kontakt mit den Platten hat, ist das elektrische Feld, das an den Proteinen zerrt, entsprechend groß. Die Transfergeschwindigkeit ist deshalb deutlich höher als beim Tank- oder Kontaktblotting und spätestens nach einer Stunde ist der Blot über der Bühne.
Noch schneller geht das Ganze mit modernen Semi-Dry-Schnellblottern und Transferpuffern mit hohen Ionenstärken, die konstante Stromstärken von mehreren Ampere bei einer Spannung von 25 Volt erlauben. Schnellblot-Systeme kommen in der Regel ohne zusätzliche Kühlung aus und verkürzen die Transferzeit auf wenige Minuten.
Aber auch die Konkurrenz des Western Blots schläft nicht und setzt ihm immer stärker zu. Mittlerweile sind zum Beispiel massenspektrometrische Methoden zur Proteinquantifizierung deutlich genauer als der im besten Fall halbquantitative Western Blot. Sie dürften diesen deshalb schon bald als Goldstandard für die Quantifizierung von Proteinmengen in der Zelle ablösen.
Existenzbedrohender für den Western Blot ist aber eine neue Western-Technik mittels Kapillar-Elektrophorese, die gänzlich ohne Blot auskommt. Bei dieser findet die Trennung der Proteine nach Ladung oder Größe sowie die Immunodetektion in der Kapillar-Elektrophorese-Säule statt. Die aufgetrennten Proteine binden photochemisch an die Säulenmatrix und werden direkt in der Säule mit Primär- und konjugierten Sekundärantikörpern detektiert. Nach Angaben des Herstellers sind die hieraus gewonnen Daten nicht nur quantitativ sondern auch reproduzierbar.
So langsam scheint es also auch für den klassischen Western Blot eng zu werden.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 01/2014, Stand: Januar 2014, alle Angaben ohne Gewähr)
