Der Star in diesem englischen Labor ist ein alter analoger Thermomixer aus den Achtzigerjahren der noch immer funktioniert. Wurden die damals tatsächlich in dieser grauslichen Farbe ausgeliefert? Oder ist das Plastik einfach nur komplett ausgebleicht? Foto: Eppendorf UK
(08.05.2020) Thermomixer werden bei unzählichen Assays und Protokollen zum Mischen und Heizen benutzt. Bei einem speziellen Assay katalysiert der Thermomixer jedoch die Umwandlung eines normalen Proteins in seine tödliche Isoform.
Thermomixer zählen eher zu den grauen Mäusen im Labor, auch wenn ihnen einige Hersteller zumindest ein bisschen Farbe gönnen und die Ecken ein wenig abrunden. So sehen sie zumindest etwas gefälliger aus und sind auch angenehmer zu bedienen.
Viel mehr lässt sich aber auch nicht aus dem Design der kleinen Zappelphilippe herausholen, die fast immer nach dem gleichen Muster gestrickt sind: Auf einem Grundgehäuse mit der ungefähren Größe eines Schuhkartons sitzt ein austauschbarer Thermoblock, der verschiedene Reaktionsgefäße oder Mikrotiterplatten aufnehmen kann. Über eine exzentrisch angeordnete Antriebswelle ist der Block mit einem Elektromotor verbunden, dessen Rotation in eine kreisförmige Schüttelbewegung mit einer winzigen Kreisbahn (Orbit) von meist zwei oder drei Millimetern übertragen wird. Mithilfe von Touch Pads an der Front des Gehäuses stellt man Temperatur sowie Schüttelfrequenz ein, die im Bedienfeld in einem Display angezeigt werden.
Der schlichte Aufbau von Thermomixern sollte aber nicht darüber hinwegtäuschen, dass die Geräte ausgefeilte Steuermodule enthalten, die sowohl die eingestellte Temperatur als auch die Schüttelfrequenz äußerst präzise regeln. Die Temperatur überwacht zumeist ein sogenannter PID-Regler, der Abweichungen vom Sollwert sehr schnell und ohne über- oder unterzuschwingen nachjustiert. Für die Einhaltung der Schüttelfrequenz ist eine elektronische Drehzahlregelung zuständig, die den Mixerblock beim Start sanft beschleunigt und danach seine Drehzahl konstant hält. Die Elektronik macht sich insbesondere bei hohen Umdrehungen bezahlt, die für das Mischen sehr kleiner Volumina nötig sind – etwa in Mikrotiterplatten. Läuft der Mixer mit konstanter Drehfrequenz, bewegt sich die Flüssigkeit in den Wells gleichmäßig mit und bildet einen Rotationskörper mit parabelförmigem Querschnitt. Schwankt die Drehzahl hingegen nur unmerklich, fängt der Mixer an zu vibrieren. Einzelne Tropfen werden hierdurch aus der rotierenden Flüssigkeit herausgeschleudert und landen an der Wandung oder der Deckelinnenseite. Die Tropfen kann man zwar wieder herunterzentrifugieren, an der nur unvollständig gemischten Probe ändert dies jedoch nichts.
Die Drehzahl von Standard-Thermomixern lässt sich meist zwischen 200 und 2.000 Umdrehungen pro Minute (UpM) stufenlos einstellen. Bei einem Orbit von zwei oder drei Millimetern reicht dies für das Mixen von Ansätzen in kleinen Reaktionsgefäßen oder 96-Well-Mikrotiterplatten aus. Um auch kleinere Volumina, etwa in 384-Well-Platten, schnell und effektiv zu mischen, sind Geräte mit bis zu 3.000 UpM nötig. Bei 1.536-Well-Platten ist dann so langsam das Ende der Fahnenstange erreicht. Die winzigen Flüssigkeitsmengen in 1.536-Wells setzen sich nur mit schwindelerregenden Drehzahlen von bis zu 5.000 UpM in Bewegung. Entsprechend klein muss die Umlaufbahn des Mixers sein, um das Überschwappen der Flüssigkeiten zu verhindern. Der Orbit dieser speziellen Hochdurchsatz-Mixer, die üblicherweise in Roboter-Straßen integriert werden, beträgt gerade mal 1,2 Millimeter.
Sehr praktisch aber etwas teurer sind Thermomixer mit integrierten Peltier-Elementen, die nicht nur heizen, sondern auch kühlen. In der Regel sind die Peltier-Elemente so ausgelegt, dass sie den Misch-Block bis zu 20°C unter Raumtemperatur kühlen können.
Biowissenschaftler verwenden Thermomixer bei unzähligen Labor-Protokollen zum Mischen und Temperieren von Proben, die von Enzymverdau, reverser Transkription über Transfektion und Bakterienanzucht bis zu Proteinlabelling oder Immunpräzipitation reichen.
Es gibt aber auch einen Assay, bei dem der Thermomixer nicht nur als simpler Rührer fungiert, sondern tatsächlich als Katalysator für eine spezielle Nachweis-Reaktion. Dieser Test nennt sich Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC). Er wird verwendet, um das fehlgefaltete Prion-Protein PrPTSE (PrPSC) nachzuweisen, das Prionenkrankheiten beziehungsweise transmissive (übertragbare) spongiforme Enzephalopathien (TSE) auslöst wie zum Beispiel die Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJK).
Beim Quaking-Induced Conversion-Assay katalysiert die Schüttelbewegung des Thermomixers die Umwandlung des normalen Prion-Proteins PrPC (a) in die fehlgefaltete, pathologische Variante PrPSC (b). Illustration: Recorder
Bei Prionenkrankheiten wandelt sich das normale, in vielen Zellen vorkommende Prion-Protein PrPC in die pathologische Isoform PrPTSE um. Während PrPC viele alpha-Helices enthält, besteht PrPTSE vorwiegend aus beta-Faltblättern, ist zudem schlechter löslich und wird von Proteasen nicht abgebaut.
Nach dem Tod von CJK-Patienten lässt sich PrPTSE sehr einfach mit histologischen und biochemischen Verfahren im Gehirn aufspüren. Weitaus schwieriger ist der Nachweis in lebenden Patienten. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat zwar verschiedene Kriterien für einen CJK-Verdacht festgelegt, die auf typischen klinischen Symptomen, Magnetresonanz-Bildgebung, Elektroencephalographie und Biomarkern basieren. Keines dieser Detektionsverfahren ist jedoch spezifisch für CJK – endgültige Gewissheit bringt erst der Test nach dem Tod des Patienten.
Dies könnte sich mit dem RT-QuIC-Assay ändern, der PrPTSE wesentlich genauer bereits in noch lebenden Probanden erkennt. Der biochemische Hintergrund des Schüttelassays ist relativ simpel: In den Proben enthaltenes PrPTSE katalysiert den Umbau eines rekombinanten, normalen Prion-Protein-Monomers zu Fibrillen. Durch Schütteln werden die Fibrillen immer wieder aufgebrochen, wodurch viele neue PrPTSE-Proteine entstehen, die den Prozess weiter beschleunigen. Die Fibrillen weist man schließlich mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Thioflavin T nach, der nur an die Faserstrukturen bindet, nicht jedoch an die PrPC-Monomere.
Den RT-QuIC-Assay führten Prionenforscher bisher meist mithilfe eines Mikroplatten-Readers durch. Dazu mussten sie jedoch die Mixerfunktion des Readers mit einer zusätzlichen Software frisieren, um die für den Test verwendete Umdrehungszahl von 900 Umdrehungen pro Minute zu erreichen.
Die Probe wird beim RT-QuIC-Test bei 42°C immer wieder für 90 Sekunden geschüttelt und ruht danach 30 Sekunden. In Abständen von 45 Minuten misst der Mikroplatten-Reader jeweils die Fluoreszenz in den Proben. Der auf diese Weise durchgeführte RT-QuIC-Assay dauert geschlagene 90 Stunden. Nach diesem Schüttelmarathon ist der Mikroplatten-Reader aber meist komplett durchgenudelt und gibt frühzeitig den Geist auf.
Prionenforscher kamen deshalb auf die Idee, die Proben auf einem üblichen Thermomixer zu schütteln und nur die Fluoreszenzmessung mit dem Platten-Reader durchzuführen. Der Assay dauerte aber immer noch mehrere Tage (J. Clin. Microbiol. 54: 1751-54). Eine Gruppe der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) um Luisa Gregori half ihm jedoch mit ein paar simplen Änderungen der Versuchsparameter auf die Sprünge (PLoS ONE 14(12): e0225904).
Gregoris Mitarbeiter reduzierten dazu die Umdrehungszahl von 900 auf 700 UpM, verkürzten die Schüttelzeit von 90 Sekunden auf eine Minute und dehnten die Ruhepause von 30 Sekunden auf eine Minute aus. Die Fluoreszenz maßen sie nicht kontinuierlich, sondern am Schluss des Assays (Endpunkt-QuIC). Mit diesen Einstellungen dauerte die ganze Chose nur noch achtzehn Stunden. Erhöhten die US-Forscher die Temperatur zusätzlich auf 55°C, war der PrPTSE-Nachweis bereits nach acht Stunden erledigt.
Warum der QuIC-Assay auf dem Thermomixer generell schneller verläuft als auf dem als Kontrolle verwendeten Platten-Reader, ist Gregoris Team nicht ganz klar. Die Forscher vermuten, dass die verschiedenen Orbits von Thermomixer und Platten-Reader dafür verantwortlich sein könnten. Während der Schüttler des Platten-Readers eine doppelte Umlaufbahn mit einem Durchmesser von 1,35 Millimetern beschreibt, kreist der Schüttelblock des Thermomixers mit einem Orbit von drei Millimetern um seine Achse. Die Schüttelfrequenz scheint dagegen nicht so ausschlaggebend zu sein. Die Gruppe beobachtete keine schnellere Bildung von Fibrillen, wenn sie die Umdrehungszahl des Schüttlers von 700 auf 1.000 UpM erhöhte.
Statt einen Mikroplatten-Reader nach dem anderen mit dem RT-QuIC-Assay vorzeitig zu verschleißen, empfiehlt Gregori deshalb, mehrere Thermomixer anzuschaffen, und den Platten-Reader nur für die Fluoreszenzmessung zu verwenden.
Passende Thermomixer findet man dazu auf den nächsten Seiten jedenfalls genug.
Thermomixer im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 5/2020, Stand: April 2020, alle Angaben ohne Gewähr)