(08.12.2020) Tischzentrifugen sind die Alleskönner unter den Zentrifugen. Dank austauschbarer Rotoren können sie fast mit jedem Laborgefäß Karussell fahren. Mit einem speziellen Bauteil bestückt, werden sie sogar zum Zentrifugen-Kraft-Mikroskop.
Tischzentrifugen waren mit die ersten Geräte in biowissenschaftlichen Laboren. Bereits 1869 trennte Friedrich Miescher in seinem Tübinger Schlosslabor Lymphozyten-Zellkerne, die er aus eitrigen Verbänden gewann, mithilfe einer Zentrifuge von den restlichen Zellbestandteilen. Wie Mieschers historische Zentrifuge aussah, ist nicht überliefert. Es dürfte aber eine kleine, mit Reagenzgläsern bestückte Zentrifuge gewesen sein, die er mit einer Handkurbel in Bewegung setzte.
Dass Miescher als erster Wissenschaftler DNA isoliert hatte, geriet schnell in Vergessenheit. Seine Idee, einzelne Zellkomponenten mithilfe der Zentrifugalkraft zu trennen, verbreitete sich jedoch rasch in den Laboren von Biochemikern und Medizinern. Zum endgültigen Durchbruch verhalf ihr der Schwede The (Theodor) Svedberg, der in den 1920er-Jahren an der Universität Uppsala eine Analytische Ultrazentrifuge (AUC) konstruierte.
Aus seinen theoretischen Arbeiten zum Sedimentationsverhalten von Makromolekülen in einem Zentrifugalfeld wusste Svedberg, dass sehr hohe Zentrifugalbeschleunigungen (RCF) nötig waren, um die Molekulargewichte von Makromolekülen zu bestimmen – und er musste einen Weg finden, sie während der Sedimentation beobachten zu können.
Svedberg installierte deshalb ein optisches System im Inneren der Zentrifuge. Dieses bestand im Wesentlichen aus einer unterhalb des Rotors angeordneten Lichtquelle sowie einer darüber installierten Kamera, die Bilder der sedimentierenden Makromoleküle schoss. Damit die Lichtstrahlen die Proben passieren konnten, verwendete Svedberg zudem einen geschlitzten Rotor. Bereits mit seinen ersten AUC-Prototypen erreichte Svedberg eine Zentrifugalbeschleunigung, die etwa dem hundertausendfachen der Erdbeschleunigung (g) entsprach. Mit ihnen ermittelte er die Molekulargewichte verschiedener Proteine, wie zum Beispiel Hämoglobin und Serumalbumin, wofür er 1926 den Nobelpreis erhielt. Svedberg arbeitete auch danach verbissen daran, die Zentrifugalbeschleunigung seiner AUC weiter zu erhöhen, bis er seinem Ziel von einer Million g schließlich recht nahekam. Dabei ließ er sich auch nicht von explodierenden Rotoren abschrecken, die ihm bei mehreren zehntausend Umdrehungen pro Minute und 900.000 g um die Ohren flogen. Im Dauerbetrieb schafften seine Ultrazentrifugen mit gekühlten und im Vakuum laufenden Rotoren aber immerhin schon 525.000 g.
Nach Svedbergs Pionierarbeit wurde die AUC von einigen wenigen Zentrifugenherstellern weiterentwickelt, die schließlich die Eine-Million-g-Grenze knackten. Möglich wurde dies insbesondere durch extrem stabile und dennoch leichte Rotoren aus Titan oder Kohlefasern, die den enormen Belastungen während der Ultrazentrifugenläufe standhalten. Auch das optische System brachten die Zentrifugenbauer mit Xenon-Blitzlampen und Photomultiplier-Röhren auf den aktuellen Stand.
Am zugrundeliegenden Prinzip der analytischen Ultrazentrifugation hat sich jedoch seit Svedberg nichts Wesentliches geändert.
Aufgrund der teuren und komplizierten Technik sind Ultrazentrifugen aber eher etwas für Spezialisten und zählen zu den Exoten unter den Tischzentrifugen.
Weit häufiger anzutreffen und aus keinem Labor wegzudenken sind dagegen Tischzentrifugen mit moderaten Umdrehungszahlen bis etwa 20.000 Umdrehungen pro Minute (RPM) und Zentrifugalbeschleunigungen von 30.000 RCF, die mit verschiedenen Rotoren und Probengefäßen bestückt werden können. Eigentlich lässt sich fast jedes Laborgefäß mit den vielseitigen Alleskönnern im Kreis herumschleudern, angefangen von Eppendorfgefäßen sowie Zentrifugenröhrchen aller Couleur mit Volumina von wenigen Millilitern bis zu einem Liter über Blutentnahmegefäße bis hin zu Mikrotiterplatten. Entsprechend kann man meist zwischen verschiedenen Festwinkel- oder Ausschwingrotoren wählen, die mit unterschiedlichen Gefäßaufnahmen beziehungsweise Adaptern ausgerüstet sind. In viele Tischzentrifugen sind zudem Kühlsysteme integriert, die die Rotorkammer in einen Eisschrank verwandeln und auf bis zu -20 Grad Celsius kühlen können.
Mit einer Tischzentrifuge kann man aber weit mehr anstellen, als nur Zellen oder gefällte Proteine und Nukleinsäuren zu pelletieren. Bereits vor zehn Jahren entwickelten Ken Halvorsen und sein Laborkumpel Wesley Wong am Rowland Institute at Harvard ein sogenanntes Zentrifugen-Kraft-Mikroskop (Centrifuge Force Microscope, CFM). Die beiden untersuchten damals, wie sich biologische Einzelmoleküle verhalten, wenn mechanische Kräfte auf sie einwirken. Diese Kräfte kann man zum Beispiel mit einem Rasterkraftmikroskop oder einer optischen Pinzette messen – wenn man sich diese sündhaft teuren Geräte leisten kann. Da Halvorsen und Wong das hierzu nötige Kleingeld fehlte, mussten sie sich etwas anderes einfallen lassen. Sie kamen schließlich auf eine ziemlich schräg klingende Idee: Die beiden hefteten tausende Einzelmoleküle mit einem Ende an die Oberfläche eines Objektträgers und hängten ein winziges Polystyrolkügelchen (Bead) an das andere. Den Objektträger montierten sie am äußersten Punkt eines Kranauslegers, der sich mithilfe eines Elektromotors um die eigene Achse drehte. Um beobachten zu können, was mit den Einzelmolekülen passiert, wenn der Arm rotiert, installierten sie auf diesem ein Objektiv sowie eine Mikroskop-Kamera und beleuchteten den Objektträger mit einer LED.
Sobald der Kranausleger schnell genug rotiert, bewegen sich die Kügelchen durch die Zentrifugalbeschleunigung zum Ende des Auslegers und ziehen die auf dem Objektträger fixierten Einzelmoleküle in die Länge. Erreichen die Kügelchen die Fokusebene des optischen Systems, sind sie im Mikroskop deutlich als dunkler Punkt zu erkennen. Wird die Drehzahl beziehungsweise die Zentrifugalbeschleunigung weiter erhöht, reißen die Moleküle entzwei, wodurch die Kügelchen aus der Fokusebene herauswandern und nur noch verschwommen zu sehen sind (Biophys. J. 98: 53-55).
Der erste Prototyp des Zentrifugen-Kraft-Mikroskops (CFM) drehte sich noch auf einer offenen Arbeitsfläche. Die nächsten Generationen haben die beiden Erfinder Wesley Wong und Ken Halvorsen in einen Zentrifugenrotor integriert. In der aktuellen Version wird das Bildsignal drahtlos via Wi-Fi vom Rotor zu einem PC übertragen. Große Darstellung. Fotomontage: Ken Halvorsen
Wong und Halvorsen ermittelten mit dem Zentrifugen-Kraft-Mikroskop zum Beispiel, wie viel Kraft nötig ist, um DNA auseinanderzuziehen. Dazu biotinylierten sie ein kurzes DNA-Fragment an beiden Enden. Ein Ende verknüpften sie mit der Streptavidin-beschichteten Oberfläche des Objektträgers, das andere mit einem Streptavidin-ummantelten Polystyrol-Bead. Mit dem CFM konnten sie beobachten, wie die DNA bei etwa 213 Umdrehungen pro Minute überdehnt wurde und begann auseinanderzureißen. Aus der Umdrehungszahl berechneten die zwei eine Zugkraft von 66 Piconewton für die Überdehnung von DNA. Das entsprach ziemlich genau dem Wert, den verschiedene andere Gruppen vorher mit wesentlich teureren Verfahren ermittelt hatten.
Der Open-Air rotierende Kran des Zentrifugen-Kraft-Mikroskops war noch eine ziemlich wilde Konstruktion, bei der jeder Sicherheitsbeauftragte die Hände über dem Kopf zusammengeschlagen hätte. Wong und Halvorsen verbesserten den Aufbau jedoch peu à peu und integrierten ihn schließlich in den Rotor-Becher einer üblichen Tischzentrifuge. Bei ihrer jüngsten, im Dezember vorgestellten Variante werden die Kamera-Bilder kabellos via Wi-Fi von der Zentrifuge an einen PC übermittelt und können mit einer einfach zu bedienenden Software ausgewertet werden (Biophys. J. 119: 1-9).
Die Wi-Fi-Lösung für das Zentrifugen-Kraft-Mikroskop inspirierte Halvorsen, der inzwischen an der University at Albany in New York forscht, auch gleich noch zur Konstruktion einer smarten Halterung für Zentrifugenröhrchen. Diese enthält fünf batteriebetriebene LEDs, die den unteren Teil des Röhrchens von der Seite beleuchten, sowie jeweils gegenüberliegend angebrachte Lichtsensoren. Dazu kommt noch ein kleiner Raspberry-Pi-Computer und ein Wi-Fi-Modul. Mehr ist nicht nötig, um die Sedimentation der zentrifugierten Proben in Echtzeit beobachten zu können.
Mit diesem einfachen optischen System kann man zum Beispiel die Sedimentation von Proben überwachen und optimieren – oder die Zentrifuge automatisch anhalten lassen, sobald die Sedimentation abgeschlossen ist. Mehr als 1.000 RPM wollte Halvorsen den als Stromquelle für die LED eingesetzten Lithium-Ionen-Batterien aber nicht zumuten: Der smarte Zentrifugen-Adapter ist also durchaus noch ausbaufähig (PLoS ONE 13(4): e0195907).
Ganz ohne Strom kommt dagegen eine putzige, kleine Zentrifuge aus, die Manu Prakashs Team an der Stanford University zusammenbastelte. Curiosity-driven Science lautet der Wahlspruch seiner Gruppe. So ist es kein Wunder, dass sich Prakash eines Tages fragte, wie das kleine Plastik-Blinkbärchen seiner Tochter funktioniert. Wenn er einen Handhebel an der Seite des Bären auf und ab bewegte, leuchtete eine Lampe auf, obwohl der Bär keine Batterie enthielt. Prakash besorgte sich im Spielzeugladen einen zweiten Blinkbären und schaute sich sein Innenleben an. Er fand darin ein raffiniertes, durch die Auf- und Abbewegung des Handhebels angetriebenes Getriebe, das einen Dynamo in eine äußerst schnelle Drehbewegung versetzte.
Prakash übernahm dieses Prinzip und fügte das Getriebe in ein Handteller-großes Gehäuse ein, das er mit einem Lasercutter aus Plexiglas herausschnitt. Den Dynamo ersetzte er durch eine kleine, als Zentrifugen-Rotor dienende Plastikscheibe, die zwei Eppendorfgefäße aufnehmen kann. Bewegt man den Hebel dieser sogenannten Handyfuge möglichst rasch auf und ab, dreht sich der Rotor nach wenigen Sekunden mit mehr als 3.000 RPM und erzeugt eine Zentrifugalbeschleunigung von weit über 500 g. Das genügt zum Beispiel für die Zentrifugenschritte eines einfachen SARS-CoV-2-LAMP-Assays, den Constance Cepko und Brian Rabe an der Harvard Medical School in Boston entwickelten (PNAS 117 (39): 24450-58).
Prakash modelte Cepkos LAMP-Assay schließlich zum Handyfuge-LAMP-Assay um, mit dem man ohne Strom und zu minimalen Kosten innerhalb von einer Stunde SARS-CoV-2 in Speichel nachweisen kann (medRxiv doi: 10.1101/2020.06.30.20143255).
Tischzentrifugen im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 12/2020, Stand: November 2020, alle Angaben ohne Gewähr)