(10.11.2021) Neue Durchflusszytometer-Konzepte setzen sich nur langsam gegen die etablierten Techniken durch. Aufzuhalten sind sie aber wohl nicht mehr, und auf lange Sicht dürften sie in den Instrumenten die Oberhand gewinnen.
Über fünfzig Jahre ist es inzwischen her, seit die drei Pioniere der Durchflusszytometrie, Joseph R. Coulter, Wolfgang Göhde und Leonard Herzenberg, die grundlegenden technischen Prinzipien und Bauteile einführten, die noch immer in konventionellen Durchflusszytometern zu finden sind: Coulter entwickelte im Los Alamos Scientific Laboratory der University of California eine Durchflusskammer, in der fluoreszierende Zellen in einem Hüllstrom aus einer Pufferlösung hydrodynamisch fokussiert und danach mit einer Quecksilberdampf-Lampe angestrahlt werden. Göhde erfand fast zeitgleich mit seinem Kollegen Wolfgang Dittrich an der Universität Münster eine Durchflusskammer, in der die Lichtimpulse der hindurchfließenden, fluoreszenzmarkierten Zellen über ein optisches System auf einen Photoelektronenvervielfacher (Photomultiplier Tube, PMT) gelenkt werden. Herzenbergs Mannschaft an der Stanford University etablierte schließlich kurz danach Laser als Lichtquelle und versah ausgesuchte Zellen nach dem Passieren der Flusszelle mit einer elektrischen Ladung, um sie mithilfe elektrisch geladener Platten in ein Auffanggefäß sortieren zu können.
Für die Detektion möglichst vieler Parameter benötigen klassische Durchflusszytometer jede Menge Laser, Filter, Spiegel und andere optische Komponenten. Spektrale Durchflusszytometer begnügen sich dagegen mit deutlich weniger Bauteilen. Foto: Radboudumc
Seit den Anfängen in den späten Sechzigerjahren wurden die Nachfolge-Modelle dieser Hüllflüssigkeit-basierten Instrumente zwar Jahr für Jahr leistungsstärker und mit immer mehr Lasern ausgerüstet, um statt nur ein oder zwei, dutzende Fluoreszenzmarker gleichzeitig detektieren zu können. An der hydrodynamischen Fokussierung der Zellen oder Partikel mithilfe eines Hüllstroms hielten die Konstrukteure der großen Durchflusszytometer-Hersteller jedoch eisern fest.
Es waren letztendlich die kleinen, zumeist von akademischen Arbeitsgruppen gegründeten Start-ups, die in den letzten Jahren mit unkonventionellen Ideen neuen Schwung in die Durchflusszytometer-Technik brachten.
Eine der Keimzellen für die Entwicklung neuartiger Durchflusszytometer ist das Los Alamos National Laboratory (LANL) in New Mexico (USA). Vor 15 Jahren konstruierte hier das Team des Physikers Gregory Kaduchak einen Durchflusszytometer, der die untersuchten Partikel oder Zellen durch akustische Wellen in der Flusszelle fokussiert. Hierzu klebten die Forscher einen Ultraschallwandler (Transducer) aus einem drei Zentimeter langen piezokeramischen Kristall in Längsrichtung an die Außenwand einer elastischen Glaskapillare. Der Schallwandler bringt die Wandung der Glaskapillare auf ihrer ganzen Länge zum Schwingen und erzeugt in ihrem Inneren eine stehende Welle, deren Knotenpunkt auf der Mittelachse der winzigen Röhre liegt. Fließen Zellen oder andere Partikel durch die Kapillare, werden sie zu dem Knotenpunkt der stehenden Schallwelle transportiert und fließen schnurgerade hintereinander aufgereiht durch die Messkammer.
Kaduchak und seine Kollegen ahnten vermutlich schnell, dass sie mit der akustischen Fokussierung einen Volltreffer gelandet hatten, und gründeten 2006 das Start-up Acoustic Cytometry Systems. Besonders lange existierte dieses jedoch nicht. Bereits 2008 schnappte sich die inzwischen zu Thermo Fisher Scientific gehörende Biotech-Firma Invitrogen Kaduchaks Ausgründung und entwickelte aus seinem Prototypen die heutigen Attune Durchflusszytometer.
Zu Kaduchaks ehemaliger Mannschaft am LANL gehörte auch der gelernte Molekularbiologe Steven Graves, der mittlerweile mit seiner eigenen Truppe an der University of New Mexico (UNM) neuartige Durchflusszytometer-Systeme auf die Beine stellt. Sein jüngster Coup ist eine sehr pfiffige Weiterentwicklung der akustischen Fokussierung, die es ermöglicht, auch Sphäroide oder Organoide mit einem Durchflusszytometer zu analysieren – und gleichzeitig die Durchflussraten sehr stark erhöht. Letzteres kann man theoretisch durch ein Mikrofluidik-System mit mehreren parallel verlaufenden Kanälen erreichen. Das funktioniert aber nur für einzelne Zellen – größere Zellaggregate, wie zum Beispiel Organoide, bleiben in den winzigen Kanälen stecken und verstopfen sie. Mit einem äußerst eleganten Trick schafft es Graves Team dennoch, die Zellen auf parallel verlaufenden Bahnen zu führen, ohne sie in winzige Kanäle zu zwängen.
Die Forscher frästen hierzu eine 2,3 Millimeter breite und fünf Zentimeter lange Aussparung in eine 200 Mikrometer dicke Siliziumscheibe (Wafer) und verschlossen die hierdurch entstandene rechteckige Aussparung mit zwei Glasplättchen, die sie auf beiden Seiten des Wafers fixierten. Um Zellen in dieser sehr weiten Flusszelle akustisch fokussieren zu können, platzierten sie anschließend einen Schallwandler über der Aussparung und klebten ihn auf einer der beiden Glasplatten fest. Stellt man die Frequenz des Transducers entsprechend ein, entsteht über die ganze Breite der Durchflusskammer eine stehende Welle mit vielen einzelnen parallel angeordneten Knotenpunkten. Treten Zellen in die Kammer ein, werden sie von der Schallenergie zu den Knotenpunkten transportiert und marschieren in eng fokussierten, parallel verlaufenden Bahnen durch die Flusskammer hindurch.
Die übliche Optik mit einem punktförmigen Laserstrahl funktioniert bei der akustischen Fokussierung mit multiplen Knotenpunkten jedoch nicht, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu detektieren. Die US-Amerikaner integrierten deshalb eine sogenannte Powell-Linse in den Strahlengang des Lasers, die den Laserstrahl zu einer Linie auffächert. Die Laserlinie ist ungefähr so breit wie die Flusszelle und wird knapp über dem Transducer durch die Glasplatte in die Durchflusskammer gelenkt.
2017 präsentierte die Gruppe die erste Konzeptstudie dieses sogenannten parallelen akustischen Durchflusszytometers mit Linien-fokussierter optischer Anregung (Anal. Chem. 89 (18): 9967-75). Ein Jahr später gründete Graves mit James Freyer, dem früheren Chef der Durchflusszytometrie am Los Alamos National Laboratory, sowie seinem Kollegen Travis Woods von der UNM das Start-up BennuBio. Dieses entwickelte den parallelen akustischen Durchflusszytometer weiter und brachte ihn in diesem Jahr als Velocyte auf den Markt.
Die stehende Welle des Velocyte enthält mindestens zehn Knotenpunkte und kann genauso viele Zellströme parallel fokussieren – der Durchsatz liegt bei bis zu zehn Millilitern pro Minute beziehungsweise über 100.000 Ereignissen pro Sekunde. Die drei werkeln aber bereits an einer erweiterten Version des Velocyte für die Analyse von Sphäroiden im Hochdurchsatz. Diese sogenannte High-Throughput Spheroid Screening Platform oder kurz HTSSP will das Start-up aus New Mexico im nächsten Jahr lancieren.
Zu den kreativsten Köpfen der Durchflusszytometer-Entwicklung zählt Joseph Paul Robinson, der an der Purdue University in Indiana, USA, die Cytometry Laboratories leitet. 2004 erfand Robinson die spektrale Durchflusszytometrie, die etliche Vorteile bietet – und die, wenn es nach ihrem Erfinder ginge, die traditionelle Technik schon längst hätte ablösen müssen. In konventionellen Instrumenten sind bis zu sieben verschiedene Laser sowie dutzende optische Komponenten und voneinander unabhängige Detektoren nötig, um möglichst viele Fluoreszenz-Parameter parallel messen zu können. Spektrale Durchflusszytometer kommen dagegen mit einigen wenigen Bauteilen aus. Das von den fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusszelle emittierte Licht wird mithilfe eines optischen Dispersionselements in die Spektralfarben zerlegt und auf einen Detektor-Array aus CCDs (Charge-Coupled Devices), PMTs oder APDs (Avalanche-Photodioden) geworfen. Um die in dem Spektrum enthaltenen Farben den einzelnen markierten Zellen zuordnen zu können, wird es anschließend mithilfe physikalischer Berechnungen wieder entmischt.
Robinson verwendete in seinem Prototypen einen einzelnen Laser für die Anregung, ein optisches Gitter für die Farbzerlegung sowie ein PMT-Array mit 32 Kanälen für die Detektion. 2011 sicherte sich der japanische Elektronik-Riese Sony Robinsons Patent für die spektrale Durchflusszytometrie. 2013 brachten die Japaner die ersten kommerziellen Geräte heraus, die mittlerweile mit bis zu sieben Lasern ausgestattet sind und über 40 Farben detektieren und auseinanderhalten können. Das Licht wird mit Prismen oder speziellen Brechungsgittern zerlegt, für die Detektion des Spektrums nutzen Sonys Ingenieure konventionelle PMT-Arrays.
Mit einer neuartigen, von der Telekommunikation abgeschauten Detektions-Technik warten hingegen die spektralen Durchflusszytometer der kalifornischen Firma Cytek auf, die seit 2017 auf dem Markt sind. In diesen wird das emittierte Fluoreszenzlicht über halbdurchlässige (dichroitische) Spiegel in Glasfaserkabel eingespeist, die es zu einer sogenannten Coarse Wavelength Division Multiplexing (CWDM)-Demultiplexing-Einheit leiten. In der Demultiplexing-Komponente sind vor jeder APD-Photodiode ein Spiegel, ein halbdurchlässiger Langpass-Filter sowie ein Bandpass-Filter angeordnet. Das Licht tritt aus dem Glasfaserkabel aus und wird über einen Spiegel auf den Langpass-Filter vor der ersten APD reflektiert. Den Filter kann aber nur Licht mit einem eng begrenzten Wellenlängen-Spektrum passieren. Der restliche Teil wird von dem Langpass-Filter auf den nächsten Spiegel geworfen, der es wiederum auf den LangpassFilter vor der zweiten Photodiode reflektiert. Dieses Spiel geht so lange weiter, bis auch die letzte Photodiode erreicht und das ganze Spektrum detektiert ist. In Cyteks Instrumenten reichen drei mit jeweils einem Detektor-Array verknüpfte Laser aus, um 24 Parameter zu bestimmen – mit fünf Lasern lassen sich bis zu 64 Parameter detektieren.
An neuartigen Durchflusszytometern basteln aber nicht nur Forscher in den USA, sondern auch in Europa. Ein aktuelles Beispiel ist die Konzeptstudie eines Hochdurchsatz-fähigen Imaging-Durchflusszytometers von Andrew deMellos Gruppe an der ETH Zürich (Cell Reports 34: 108824).
In bildgebenden Durchflusszytometern nimmt eine Mikroskop-Kamera Bilder der durch die Flusszelle strömenden Zellen auf. Um Bild-Verzerrungen zu vermeiden, müssen die Zellen möglichst exakt in der Bildebene fokussiert werden und mit gleichmäßiger Geschwindigkeit unterwegs sein. Die Schweizer erreichen dies mithilfe einer viskoelastischen Polyethylenoxid-Lösung, in der die Zellen durch einen Schlangenlinien-förmigen Mikrofluidik-Kanal strömen. Kurz vor dem Ende des Kanals werden sie mit einer Stroboskop-gesteuerten Lichtscheibe beleuchtet, die im Mikrosekunden-Takt flackert. Mit diesem Trick synchronisiert deMellos Team die Fluoreszenz-Anregung mit der Fließgeschwindigkeit der Zellen, die sich mit 0,05 Meter pro Sekunde bewegen. Ein Objektiv fängt das emittierte Licht ein und leitet es über eine entsprechende Optik zu einer CMOS-Kamera, die verzerrungsfreie Bilder der Zellen schießt.
Die Leistungsdaten des Züricher Imaging-Durchflusszytometers sind ziemlich beeindruckend. Bei einer vierzigfachen Vergrößerung erreicht es eine Bildrate von über 5.000 Zellen pro Sekunde – mit einer zehnfachen Vergrößerung und entsprechend großem Sichtfeld sogar 61.000. Da können selbst die besten kommerziellen Instrumente nicht mithalten, deren Durchsatz mit vierzigfacher Vergrößerung bei etwa 2.000 Zellen pro Sekunde liegt.
Mal sehen, ob die Schweizer ihren Prototypen auch so flott zu einem marktfähigen Gerät weiterentwickeln wie Graves Gruppe die akustische Fokussierung mit multiplen Knotenpunkten.
Durchflusszytometer im Überblick
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2021, Stand: Oktober 2021, alle Angaben ohne Gewähr)