Marcus Krüger. Foto: S. März
Ein Gespräch über Muskelnudeln, Phosphoproteomik – und die Leichtigkeit, schwere Aminosäuren in eine Maus hineinzubefördern.
Quadrupol? Flüssigkeitschromatographie? Orbitrap? SILAC? Eigentlich sollte es doch um Massenspektrometer gehen: Ein großes Gerät, in welches man vorne seine Zellen hineinschiebt und hinten eine lange Liste mit Proteinen heraus bekommt. Aber so einfach ist das alles nicht.
Fragen wir also Marcus Krüger. Seit Ende 2014 forscht der habilitierte Biochemiker am – tief Luft holen – „Cologne Excellence Cluster on Cellular Responses in Aging-associated Diseases (CECAD)“. Dieser linguale Bandwurm steht in Köln, und Krügers Arbeitsgruppe interessiert sich für posttranslationale Modifikationen, natürlich mithilfe der Massenspektrometrie.
Sein Handwerk gelernt hat Krüger bei Matthias Mann, zunächst in Odense (Dänemark), später in Martinsried. Sein früherer Chef ist dort seit 2005 Direktor am Max-Planck-Institut für Biochemie. Mann seinerseits wurde im Labor des US-amerikanischen Chemikers und Massenspektrometrie-Pioniers John B. Fenn ausgebildet, der 2002 für seine massenspektrometrische Erforschung biologischer Makromoleküle den Chemie-Nobelpreis erhielt. Die durch Fenn etablierte Methode der Elektrospray-Ionisierung (ESI) revolutionierte die Proteomik, ermöglichte sie doch die sanfte Ionisierung von Proteinen und dadurch ihre massenspektrometrische Charakterisierung.
Im Labor von Mann kam Krüger erstmals in Kontakt mit SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture; Mol Cell Proteomics 1(5): 376–86). Dabei werden Zellen mit Nährmedien gefüttert, deren essentielle Aminosäuren (etwa Lysin) durch ‚schwere‘, isotopenmarkierte Pendants ersetzt wurden. Die ‚schweren‘ Aminosäuren werden während der Proteinbiosynthese normal eingebaut, so dass nach einigen Generationen die gesamte Zellpopulation mit diesen Isotopen ausgerüstet ist. Man könnte sagen, die Zellen sind quasi ‚schwer‘.
Möchte der Forscher herausfinden, was zum Beispiel nach einer Behandlung seiner Zellen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren geschieht, dann inhibiert er die ‚schweren‘ Zellen, während unmarkierte als Kontrolle dienen. Anschließend werden unmarkierte mit markierten Zellen gemischt und anschließend gemeinsam im Massenspektrometer gemessen. In einem Aufwasch werden so Unterschiede auf Proteinebene sichtbar, denn die isotopenmarkierten Aminosäuren führen zu einer Masseverschiebung der gemessenen Peptide im Vergleich zu den unmarkierten, sequenzgleichen Peptiden.
Macht Proteomik dick? Unbestätigten Angaben zufolge wurde das linke Tier jahrelang mit schweren Aminosäuren gefüttert. Foto: www.csm.ornl.gov
Den ‚schweren‘ Zellen folgten ‚schwere‘ Mäuse, an deren Entwicklung Krüger maßgeblich mitwirkte (Cell 134(2): 353–64). Mit Krüger sprachen wir über schwere Mäuse, Muskelnudeln und die kommerzielle Anwendungen moderner Massenspektrometrie.
Herr Krüger, wie bekommt man ‚schwere‘ Aminosäuren in eine Maus?
Marcus Krüger: Das ist nicht wirklich kompliziert. Wir haben der Maus [mit ‚schweren‘ Aminosäuren versetztes] Futter gegeben und zwei Generationen gewartet. Danach war die Maus gelabelt – und wir waren in der Lage, über die stabilen Isotope in der Maus Proteine zu quantifizieren. Ferner dient die SILAC-Maus als Standard für sogenannte Spike-in-Experimente. Um beispielsweise Knockout-(KO)-Mäuse zu charakterisieren, wird deren Proteom ins Verhältnis gesetzt zu dem einer SILAC-Maus. Auch eine Wildtyp-(WT)-Maus wird mit der SILAC-Maus verglichen. Beide – KO- und WT-Maus – haben dann mit der SILAC-Maus einen identischen Nenner, so dass KO und WT verglichen werden können, ohne sie selbst labeln zu müssen. So können wir KO-Mäuse mittels Massenspektrometrie auf Proteinebene untersuchen, ergänzend zur Charakterisierung mit molekularbiologischen Methoden, Immunfärbungen und Western Blots.
Oder, ein anderes Beispiel: Caenorhabditis elegans; heutzutage bekommen wir aus einem Fadenwurm 3.000 bis 4.000 Proteine. C. elegans ist hier in Köln ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung altersbedingter Krankheiten, wie auch Drosophila. Wir haben beispielsweise in dopaminergen Neuronen von SILAC-Fruchtfliegen die humane Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) mit der R1141C-Mutation überexprimiert, einer Variante, die auch bei Parkinson-Patienten vorkommt. Diese Fliegen sterben eher, sie haben Probleme beim Laufen, Fliegen und Krabbeln. In der folgenden massenspektrometrischen Phosphoproteomanalyse haben wir ein neues potentielles Target für LRRK2 gefunden, Synaptojanin 1.
Das ist dann aber das Proteom eines gesamten Organismus. Was ist denn mit der Einzelzellproteomik?
Krüger: Das hört sich ein bisschen überheblich an. [Lacht] Wir machen natürlich keine ‚Single Cell Proteomics‘, sondern beispielsweise eine ‚Single Muscle Fibre Proteomics‘: Ein präparierter Muskel einer Maus wird mit Kollagenase verdaut, dann bleiben wie kleine Nudelstücke die Muskelfasern übrig. Die können wir uns einzeln herauspicken, sie lysieren und mit Trypsin verdauen. Die Peptidmischung geben wir auf eine Chromatographie-Säule, von welcher diese mittels aufsteigender Konzentration organischer Lösungsmittel sukzessive gelöst und separiert werden. Mithilfe von ESI können wir die Peptide ionisieren, um anschließend mit einem hochauflösenden Massenspektrometer die exakte Masse zu detektieren. Außerdem sind solche Hybridmassenspektrometer wie das Quadrupol-Orbitrap in der Lage, Peptide zu fragmentieren, um deren Sequenz und mögliche posttranslationalen Modifikationen zu identifizieren. Mit unserer Technik liegen wir bei etwa 1.500 Proteinen, die wir aus einer Muskelfaser und somit einer distinkten Zellpopulation erhalten.
Wenn Sie Muskelfasern isoliert und ein Proteom erstellt haben, was bringt Ihnen das konkret?
Krüger: Es gibt viele humane Erkrankungen, die eine pathologische Veränderung des Muskelgewebes hervorrufen, wie Diabetes oder Krebs. Oder – ganz banal – eine Immobilisierung nach einem Beinbruch. Innerhalb kurzer Zeit verlieren diese Patienten einen Teil ihrer Muskelmasse. Eine Regeneration ist nicht immer ohne Weiteres möglich. Im Mausmodell induzieren wir eine solche Muskelatrophie und untersuchen dann einzelne Muskeltypen. Eine Typ1-Faser im Gastrocnemius-Muskel zum Beispiel verhält sich anders als eine Typ1-Faser im Soleus-Muskel. Man kann sich überlegen: Wenn ich Proteindegradation habe, müsste ich doch vermehrt Ubiquitinierung finden – denn das ist in vielen Fällen ja das Signal, Proteine proteosomal zu degradieren. Finden wir also Proteinubiquitinierungen? Können wir Signalwege oder bestimmte Muster erkennen?
Das sind recht klinische Ansätze. Ist der nächste Schritt die Kommerzialisierung der Massenspektrometrie für die klinische Forschung? Oder gibt es die bereits?
Krüger: Es gibt bereits Firmen, die massenspektrometrischen Service anbieten. Toplab bei München zum Beispiel ist so eine. Für die Zukunft kann ich mir schon vorstellen, dass es ähnlich wie beim DNA-Sequenzieren etliche kommerzielle Angebote geben wird. Allerdings ist das nicht so ‚straight forward‘ wie bei der DNA-Sequenzierung, da die Kundenbedürfnisse sehr unterschiedlich sein werden: Einige Leute wollen globale Proteome messen, andere nur eine Immunpräzipitation; wieder andere wollen nur schauen, was miteinander interagiert oder auf eine bestimmte Art modifiziert ist, von Phospho bis Glyko. Das ist nicht trivial, die Firmen müssen mehr auf den einzelnen Kunden reagieren.
Wäre das auch eine Option für Sie?
Krüger: Wir sind noch ganz am Anfang, aber vorstellen kann ich mir das schon. Ziel wäre eine individualisierte Krebstherapie.Bei vielen Krebsarten erhält der Patient heute Bestrahlung oder die chemische Keule – Zytostatika, die alle proliferierenden Zellen schädigen, entartete aber auch gesunde. Das sind recht unspezifische Methoden mit starken Nebenwirkungen. Mittels Massenspektrometrie können wir nun nach sogenannten Neo-Epitopen suchen, also veränderten Antigenen, die bevorzugt von Tumorzellen exprimiert werden. Sind diese Neo-Antigene identifiziert, könnten wir solche Peptide synthetisieren und den Patienten damit sozusagen vakzinieren. Dafür wird das Immunsystem hochgefahren, und der Körper kann Antikörper gegen die entarteten Zellen bilden.
Oder Brustkrebs: Dort gibt es gute Medikamente auf Basis von Phosphotyrosinkinase-Inhibitoren. Man inhibiert ein breites Spektrum an Tyrosinkinasen und bekämpft damit recht zuverlässig Tumorzellen. Aber es gibt auch immer wieder Resistenzen gegenüber diesen Inhibitoren. Hier kann Phosphoproteomik helfen, um Patienten zu screenen: Wie ändert sich nach Medikamentengabe das Phosphorylierungsmuster und wann fällt es in seinen pathologischen Zustand zurück? Eine Kombination dieser Methoden, von Genom-, Proteom- und Phosphoproteomanalyse, wird in Zukunft einen deutlichen Vorteil bei der Identifizierung von patientenspezifischen Medikamenten bringen.