Mikrobiomiker untersuchen nicht nur die Mikroorganismen im Darm – auch der Boden hält jede Menge Ein- und Mehrzeller bereit. Foto: Zymo Research
Die Mikrobiom-Forschung nimmt Fahrt auf – doch in den Workflow schleichen sich schnell Fehler ein. Die Forscher-Gemeinschaft ruft daher nach einem Standard. Die Firma Zymo Research aus Freiburg versucht zu helfen.
„Die Gesundheit unseres Körpers war uns schon immer wichtig, aber wir wussten nicht immer, worauf es ankommt. Nehmen wir etwa die alten Ägypter, die bestimmte Körperteile für das Jenseits konservierten, während sie andere Teile entfernten, wie zum Beispiel [...] das Gehirn. [...] Was wäre, wenn wir eine Art vernachlässigtes Organ hätten, von gleichem Gewicht wie das Gehirn und in mancher Hinsicht ebenso individuell charakteristisch, das wir jedoch kaum verstehen und [das] folglich unterschätzt wird? [...] Tatsächlich haben wir so etwas: unseren Darm – genauer gesagt, dessen Mikroben.“
Mit diesen Worten leitete der Mikroökologe Rob Knight von der University of California San Diego seinen Vortrag über das Mikrobiom bei der alljährlichen TED-Konferenz im Jahr 2014 ein („How our microbes make us who we are“). Das Video wurde seitdem fast zwei Millionen Mal angeklickt.
Und Knight hat wahrlich recht: Das menschliche Mikrobiom ist nur sehr schemenhaft verstanden. Warum? Zum einen hat dessen Erforschung gerade erst begonnen, zum anderen steckt auch die Mikrobiomik in einer heiklen Krise: Sie ist schwer zu reproduzieren.
Woran das genau liegt, erklärt Thomas Kuri, Virologe und wissenschaftlicher Direktor beim Biotechnologie-Unternehmen Zymo Research in Freiburg: „Um das Mikrobiom zu charakterisieren, braucht es einen langen, ‚vielschrittigen’ Workflow – da schleichen sich an vielen Stellen Fehler ein, die am Ende zu völlig unterschiedlichen Ergebnissen führen können.“
Das zeigte 2014 auch die amerikanische Journalistin Tina Hesman Saey in einem Artikel für Science News („Here’s the poop on getting your gut microbiome analyzed“). Saey hatte dieselbe Stuhlprobe für je circa 100 US-Dollar an zwei Firmen geschickt, die ihr Darm-Mikrobiom sequenzieren sollten – und zwar an American Gut und µBiome. Die Journalistin bekam ihre Sequenzdaten auch zurück – nur mit vollkommen unterschiedlichen Ergebnissen. Saey schreibt: „In fact, they were almost complete opposites of each other in regard to the proportion of Firmicutes and Bacteroidetes that make up my fecal microbiome. Firmicutes and Bacteroidetes are the two major phyla of bacteria found in the human gut, and their proportions can say a lot about what your diet and health may be.“ Was war schief gegangen?
Mit dieser Frage richtete sich Saey an µBiome und American Gut. Letztere wird übrigens von dem eingangs erwähnten Rob Knight und seinem Labor geführt.
Saey bekam eine Reihe von technischen Erklärungen, was ihre Ergebnisse verzerrt haben könnte, und kommt in ihrem Artikel zum Schluss, dass jeder Schritt im Mikrobiomik-Workflow der mögliche Übeltäter sein könnte. Oder wie Knight es in Saeys Artikel formuliert: „All sorts of unlikely things are possible, and finding out which one is true is difficult.” Und weil jedes Labor sein eigenes Süppchen kocht, wundert sich niemand mehr über vollkommen unterschiedliche Ergebnisse – aber jeder ärgert sich: „Die ganze Mikrobiomik-Gemeinschaft schreit nach Standards“, fasst Zymo-Research-Forscher Kuri die Misere zusammen.
Doch wo liegen die Schwachstellen, und wie können Mikrobiomiker diese beheben? Eine große Fehlerquelle ist beispielsweise die Lagerung und der Versand der Proben. „Es gibt immer noch Unternehmen, die Mikrobiom-Sequenzierungen anbieten und ihre Kunden die Proben unstabilisiert bei Raumtemperatur verschicken lassen“, empört sich Kuri.
Die Auswirkungen von unterschiedlichen Transport-Arten konnten Knight et al. dieses Jahr bestätigen (Am. Soc. Microbiol., doi: 10.1128/mSystems.00031-18). Sie zeigten, dass je nachdem, wie die Proben gesammelt oder verschickt wurden, verschiedene Bakterien-Gruppen regelrecht aufblühten.
„Wenn Mikrobiom-Proben den Darm verlassen, betreten sie eine Umwelt mit völlig anderen Bedingungen“, erklärt Kuri. „Je nach Spezies kommen Mikroorganismen damit besser oder schlechter zurecht.“ Deshalb sei es unabdingbar, die Probe nach Entnahme augenblicklich zu stabilisieren, sodass die Mikroorganismen auf Umweltbedingungen gar nicht erst reagieren können.
Eine Möglichkeit ist die sofortige Kryokonservierung, dies erfordert jedoch erheblichen logistischen Aufwand. Und auch das Einfrieren und Auftauen gehen nicht spurlos an den Einzellern vorbei, weiß Kuri. Außerdem ist es im Vergleich zur Lagerung bei Raumtemperatur recht teuer, die Organismen dauerhaft eingefroren zu halten und derart eventuell noch zu verschicken.
Viele Mikrobiom-Forscher setzen deshalb auf Puffer. „Ein Puffer stabilisiert die Probe und die Zellen werden inaktiviert“, so Kuri. Einige Produkte auf dem Markt sind sogenannte Hochsalzpuffer. Da diese jedoch mit einigen Folgeschritten der Mikrobiom-Auswertung nicht kompatibel seien und deshalb wieder entfernt werden müssen, hat Zymo Research den DNA/RNA Shield Puffer entwickelt. „Was da genau drin ist und wie der Puffer funktioniert, bleibt ein Firmengeheimnis, das nur sehr wenige Personen kennen“, meint der Freiburger Forscher. „Die Rezeptur gewährleistet jedoch, dass der Puffer mit dem weiteren Mikrobiomik-Workflow kompatibel ist.“
Ursprünglich entwickelt wurde die Mixtur laut Kuri übrigens auf Bitte des US-Militärs. „Der Gesundheitszustand von Soldaten wird regelmäßig kontrolliert und auf Krankheiten überprüft.“ Und obwohl die Blut-, Urin- oder Stuhlproben im Feld entnommen würden, müssen sie verwertbar im Analyse-Labor ankommen – deshalb der Inaktivierungs- und Stabilisierungpuffer.
Ein weiterer Vorteil des Puffers: Durch die Inaktivierung der Mikroorganismen sind sie nicht mehr infektiös, was gerade in der Klinik das Handling und den Transport stark vereinfacht. Und selbst ohne Kühlung lässt sich die Probe im Puffer mindestens einen Monat lagern. Doch tragen die Zellen keine Schäden durch die Puffergabe davon? „Einige Zellen werden durchaus lysiert“, gibt Kuri zu. Aber das sei nicht schlimm, die Zellen würden ohnehin für die DNA- oder RNA-Extraktion aufgeschlossen.
Hier wartet schon die nächste Mikrobiomik-Schwachstelle im Workflow. Denn jeder Mikroorganismus lässt sich unterschiedlich leicht oder schwer knacken. „Viele Lyse-Protokolle sind beispielsweise für grampositive Bakterien nicht ausreichend“, weiß Kuri. Auch Pilze und Sporenbildner seien sehr hartnäckig; gramnegative Bakterien ließen sich hingegen schon recht leicht lysieren. Ein nicht ausgereiftes Protokoll kann im schlimmsten Fall eine Mikroorganismen-Gruppe überhaupt nicht aufschließen, sodass diese in den finalen Analyse-Daten gar nicht erst auftaucht. „Auf diese Weise kann es passieren, dass das erhaltene Profil nicht die Tatsachen widerspiegelt“, sagt Kuri. Das Human Microbiome Project vom Jahr 2012 setzte beispielsweise auf eine dreifach Lyse: mechanisch, enzymatisch und thermisch.
Zymo Research hat für sich eine andere Lösung gefunden: Hochverdichtete Keramik-Beads in zwei Größen. „Glas-Beads können zu scharfkantig sein und würden die DNA unnötig schneiden“, erklärt Kuri. Die Probe kommt mit einer Lyse-Matrix bestehend aus 0,1 und 0,5 Milimeter großen Keramik-Kügelchen in ein Tube und wird mit einem sogenannten Sample-Processor aufgeschlossen. „Bei einem sogenannten High-Speed Homogenizer können fünf Minuten reichen, um ein optimales Ergebnis zu erzielen – dann ist die optimale DNA-Ausbeute erreicht und das genetische Material noch nicht zu sehr fragmentiert. Bei sogenannten Slow-Speed Homogenizern kann die Lyse-Zeit zwanzig Minuten und mehr betragen, um das gleiche Resultat zu erzielen.“ Bei second-Generation-Sequencing ist die DNA-Zerstückelung übrigens weniger kritisch, für neuere Sequenziermethoden der dritten Generation brauchen Mikrobiom-Forscher möglichst lange und intakte DNA-Stücke.
Doch wie hat Zymo Research überhaupt herausgefunden, dass gerade diese beiden Bead-Größen so gut funktionieren? Mit einem Standard. Diesen hat das Unternehmen seit kurzem im Gepäck. Enthalten im ZymoBIOMICS Microbial Community Standard sind insgesamt zehn Mikroorganismen, die unterschiedlich schwer oder leicht zu lysieren sind. Mit dabei sind drei gramnegative und fünf grampositive Bakterien sowie zwei Hefe-Arten; sieben davon sind humanpathogen. „Damit können Forscher ihren Workflow auf Fehler überprüfen“, erklärt Kuri. „Der Standard enthält weniger als 0,01 Prozent fremde mikrobielle DNA. Kommt also am Ende nicht das raus, was auf der Verpackung steht, hat sich irgendwo eine Kontamination oder ein Fehler eingeschlichen. Dann sollte der Workflow überarbeitet werden.“
Doch auch die Vervielfältigung der genetischen Information ist fehleranfällig. So inhibieren viele pflanzliche Bestandteile wie Polyphenole, Tannine und Huminsäuren die PCR. „Neben dem Mikrobiom des menschlichen Darms liegen auch Bodenproben im Fokus der Mikrobiom-Forscher, und beide Probenarten enthalten sehr häufig diese Inhibitoren.“ Diese Störstoffe können mittlerweile relativ problemlos über spezielle Säulen entfernt werden – man muss nur daran denken.
Zuletzt sind natürlich auch die bioinformatischen Softwares nicht frei von Fehlern. Denn verschiedene Softwares verwenden unterschiedliche Strategien, um die Sequenzdaten zu klassifizieren und können auch hier zu unterschiedlichen Ergebnissen führen.
Der Ruf der Mikrobiomiker nach einem Standard ist demnach mehr als nachvollziehbar. 2017 haben sich führende Mikrobiom-Forscher zusammengetan und einen solchen Standard formuliert (Nat. Biotechnol. 35: 1069-76). Dem zugrunde liegen Produkte der Firma Qiagen, die jedoch etwas modifiziert wurden. Das begründet Letztautor Peer Bork vom European Molecular Biology Laboratory (EMBL) in Heidelberg wie folgt: „Wir hatten damals bei vielen Arbeitsgruppen angefragt, was benutzt wird, und dies dementsprechend reflektiert. Und Qiagen war schon damals angesagt.“ Die Produkte von Zymo Research hatten Bork und Co. nicht getestet. Das bedauert Kuri natürlich: „Leider haben die Autoren unsere Produkte noch nicht auf dem Schirm gehabt. Aber das ändert sich sicherlich in der nächsten Zeit.“
Tatsächlich steht die von Bork et al. standardisierte DNA-Extraktions-Methode wieder auf dem Prüfstand. „Es gibt ständig neue Entwicklungen, was natürlich Standards schwierig macht“, erklärt der EMBL-Bioinformatiker. „Deshalb hatten wir empfohlen, neue Methoden gegen etablierte sorgfältig zu benchmarken.“ Ein weiterer Aspekt sei die Automatisierbarkeit von Methoden, die trotz Versprechen verschiedener Firmen zumindest bei Stuhlproben noch ungenügend sei. „Wir haben selber vieles getestet, und bei RNA wird es noch komplexer“, gibt Bork zu. Die Mikrobiomiker scheinen also noch alle Hände voll zu tun zu haben.