(11.11.2020) Das COVID-19-NMR-Konsortium aus zweihundert Wissenschaftlern sucht nach therapeutisch relevanten Zielstrukturen im Genom und Proteom von SARS-CoV-2. Warum setzen sie dafür gerade auf die komplizierte NMR-Spektroskopie?
RNA-Genome sind Gestaltwandler. Sie müssen einen Replikationskomplex bilden, an Ribosomen binden, Abwehrmechanismen ihrer Wirte entkommen und sich zu neuen Viruspartikeln zusammenfinden. Dafür alternieren ihre RNA-Elemente zwischen verschiedenen Konformationen. Ihre Bindungsstellen, auch für antiviral wirkende Liganden, finden sich fast ausschließlich in unstrukturierten Bereichen – in Haarnadelstrukturen, internen Schleifen und Ausbeulungen.
Für die Strukturbiologie sind variable RNA-Elemente Herkulesaufgaben. Die Röntgenkristallografie kann zwar zehn Megadalton schwere Ribonukleoproteinkomplexe auf ein Ångström genau auflösen – aber nur wenn die beteiligte RNA wohlgeordnete Kristalle bildet. Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) erreicht die atomare Auflösung nur mit RNA, die leichter ist als 35 Kilodalton. Die Kryo-Elektronenmikroskopie (EM) löst zwar 200 Kilodalton bis 20.000 Megadalton schwere Strukturen im Subnanometerbereich auf, RNA ist für sie aber Neuland. Die Röntgen-Kleinwinkelstreuung (SAXS) überbrückt schließlich die Größenbegrenzungen von NMR und Kryo-EM. Sie funktioniert jedoch nur mit homogenen Proben und löst diese auf zehn bis fünfzig Ångström genau auf. Wenig überraschend stammen lediglich zwei Prozent aller Einträge in der Strukturdatenbank (rcsb.org) von DNA- und RNA-Strängen.
Der Koordinator des COVID-19-NMR-Konsortiums Harald Schwalbe bei einem Videodreh über das Projekt. Foto: Covid-19-NMR
Konformationelle Flexibilität zeichnet auch virale Proteine aus. Für sie ist Anpassungsfähigkeit wichtiger als thermodynamische Stabilität – ungeordnete Proteinbereiche federn schädliche Mutationen durch absichtlich fehleranfällige Polymerasen besser ab als starre Domänen. Mutiert ein virales Protein, verliert es im Durchschnitt weniger konformationelle Stabilität als seine pro- und eukaryotischen Gegenstücke. Ungeordnete Proteine erlauben es Viren außerdem, mehrere Immunkomponenten ihres Wirts zu beeinflussen, ohne ihr Genom vergrößern zu müssen.
Auch Unordnung in Proteinen kann weder kristallographisch oder elektronenmikroskopisch noch durch Homologie-Modellierung erfasst werden. Tatsächlich enthalten fünfundsiebzig Prozent aller Proteine in der Strukturdatenbank ungeordnete Bereiche ohne verzeichnete Elektronendichte (J. Biomol. Struct. Dyn. 24(4): 25-42). Intrinsisch ungeordnete Proteine befinden sich sogar komplett im toten Winkel der Strukturaufklärung.
Diese strukturbiologischen Herausforderungen sind bei SARS-CoV-2 mit einer nie gekannten Dringlichkeit zur pharmakologischen Intervention verknüpft. Das RNA-Genom des Virus enthält 29.903 Nukleotide, die in 14 offenen Leserahmen (ORF) für 27 Proteine codieren. In den 5‘- und 3‘-untranslatierten Regionen (UTR) seines Erbguts finden sich mindestens 18 cis-wirkende RNA-Elemente, die die virale Replikation, subgenomische mRNA-Produktion und Translation regulieren.
Wenig ist über ihre Struktur-Funktions-Dynamik bekannt. Bisherige Strukturmodelle beruhen auf In-silico-Methoden der RNA-Strukturvorhersage, der Varianzanalyse von Begleitmutationen und Homologie-Modellen.
Auf Proteinseite sieht es besser aus. Viele der Struktur- und Nicht-Struktur-Proteine (NSP) von SARS-CoV-2 sind dank ihrer bis zu achtzigprozentigen Sequenzähnlichkeit zu SARS-CoV bekannt. Strukturmodelle existieren für die pharmakologisch bedeutsame 3C-ähnliche Protease (NSP5), RNA-abhängige RNA-Polymerase (NSP12), Endoribonuklease (NSP15) und die Rezeptor-bindende Domäne des Spike (S)-Proteins (ncbi.nlm.nih.gov/Structure/SARS-CoV-2.html).
Ungeordnete Regionen enthalten laut Vorhersage-Werkzeugen zwei Drittel des Nukleokapsid-Proteins, ein Viertel des RNA-Polymerase-Co-Faktors NSP8, der C-Terminus des Interferon-Inhibitors ORF6 sowie alle Schnittstellen des Polyproteins 1, aus dem NSP1 bis NSP16 durch virale Proteasen herausgeschnitten werden (Cell Mol. Life Sci. doi: 10.1007/s00018-020-03603-x). Selbst das S-Protein als wesentlicher pharmakologischer Ansatzpunkt enthält mehrere molekulare Erkennungsmuster intrinsisch ungeordneter Proteine (Infect. Genet. Evol. 85: 104510). Für das antivirale Wirkstoffdesign stellen starre Strukturmodelle von SARS-CoV-2-Makromolekülen zweifelsohne Meilensteine dar. Doch kann es sich die Arzneimittelentwicklung leisten, intrinsische Unordnung zu missachten? Inwieweit treibt die konformationelle Variabilität viraler Bestandteile die COVID-19-Pathogenie an?
NMR-Spektroskopie ist das einzige biophysikalische Verfahren, das neben hochaufgelösten Strukturmodellen auch Informationen zu deren Dynamik bereitstellt. Dafür stehen verschiedene NMR-Observablen auf einer Zeitskala von Minuten bis Pikosekunden zur Verfügung – für die Diffusion von Megadalton-Komplexen über allosterische Konformationsänderungen bis hin zur Vibration chemischer Bindungen. Analysiert werden chemische NMR-Verschiebungen, differentielle Linienverbreiterungen, transversale und longitudinale Spin-Relaxationsraten, skalare und dipolare Kopplungen, Aspekte der chemischen Verschiebungsanisotropie, Sättigungstransferraten beispielsweise durch den Kern-Overhauser-Effekt, Protonen-Deuterium-Austauschraten und die paramagnetische Relaxationsbeschleunigung. Die Summe dieser Werte und Raten macht die Enthalpie- und Entropiebeiträge jedes Atoms eines Makromoleküls zur Thermodynamik und Kinetik des Gesamtsystems zugänglich.
„Wie könnte NMR zur Überwindung von COVID-19 beitragen?“, fragte sich deshalb Harald Schwalbe, stellvertretender geschäftsführender Direktor am Zentrum für Biomolekulare Magnetische Resonanz (BMRZ) der Goethe-Universität Frankfurt am Main, an einem Freitagnachmittag Ende März 2020. „Boris Fürtig, ein Habilitand unseres Instituts für Organische Chemie und Chemische Biologie, hatte die Frage gestellt, ob wir zur Erforschung von SARS-CoV-2 beitragen sollten. Das diskutierten wir übers Wochenende mit unseren Frankfurter Gruppenleitern Andreas Schlundt, Martin Hengesbach und Jens Wöhnert, mit der Darmstädter Expertin für RNA-Biochemie Julia Weigand und schließlich mit internationalen Kollegen. Alle waren dafür.“
Seitdem bilden sechs Forschungsgruppen des DFG-Sonderforschungsbereichs 902 „Molekulare Mechanismen der RNA-basierten Regulation“ den Kern des COVID-19-NMR-Konsortiums (covid19-nmr.de). Ihr Gesamtziel laut Schwalbe: „Wir untersuchen alle Proteine und alle regulatorischen RNAs von SARS-CoV-2 ohne ausreichende Strukturmodelle, ordnen ihre NMR-Signale zu und screenen sie mit pharmakologischen Molekülfragment-Bibliotheken.“
Insgesamt bearbeiten im Konsortium weltweit vierzig Arbeitsgruppen mit zweihundert Wissenschaftlern 12 Protein- und 18 RNA-Projekte, erklärt Schwalbe: „Die rekombinante Expression der Proteine ist neben uns auf acht Partnerstandorte verteilt. Alle RNA-Konstrukte haben wir in Frankfurt in vitro transkribiert und für NMR und Strukturanalyse teilweise zu unseren Partnern verschickt. Vier Monate lang belegten 45 PhD-Studenten und Postdocs die Hälfte unserer Frankfurter Laborfläche in zwei Schichten pro Tag an sieben Tagen die Woche mit den COVID-19-Projekten. Das war ein ganz neues Arbeiten, da die Morgenschicht ihre Projekte aufgrund der Pandemie-bedingten Personalbeschränkungen an die Nachmittagsschicht weitergab. Durch umfangreiche Parallelisierung konnten wir so vier RNA-Konstrukte in NMR-tauglichen Mengen in zehn Tagen herstellen. Die NMR-Spektren haben wir später über Zoom-Meetings zugeordnet. Ohne den Teamgeist jedes Einzelnen im Konsortium wäre diese Gemeinschaftsarbeit unmöglich gewesen!“
Alle NMR-Spektren und -Resonanz-Zuordnungen, unter anderem für das Nukleokapsid-Protein, den Protease-Komplex (NSP3), die 3C-ähnliche Protease (NSP5) und die Co-Faktoren der RNA-Polymerase (NSP7, NSP8), finden sich unter covid19-nmr.de/results-2/.
Den größten Wissenszuwachs verzeichnet das Riesenteam indes auf Seiten des SARS-CoV-2-Genoms. Es stellt experimentelle Sekundärstrukturmodelle für 13 regulatorische RNA-Elemente der 5‘- und 3‘-Enden und für zwei RNA-Konstrukte des ribosomalen Frame-Shift-Segments im 20.000 Nukleotide langen ORF1a/b zur Verfügung (Nucleic Acids Res. in press). Den gewaltigen Umfang dieses Unterfangens würdigte Nucleic Acids Research mit einem Breakthrough Paper Alert (narbreakthrough.com/category/2020-breakthrough-articles/).
Wie wenig NMR-Alltag all das ist, bezeugen vier Erfahrungswerte: (1) Die NMR-Resonanzen der vier chemisch ähnlichen RNA-Bausteine liegen in Protonenspektren nahe beieinander. Spektraler Überlapp macht Zuordnungen der Nukleobasen bei langen Sequenzen unmöglich. (2) RNA bevorzugt eher langgestreckte als globuläre 3D-Strukturen. Entsprechend lange Rotationskorrelationszeiten beschleunigen die transversale Relaxation von Protonen. Ihre NMR-Signale gehen verloren. (3) Die relative Orientierung multipler RNA-Sekundär-Strukturelemente wird durch Abstandsmessungen langer Reichweite zugänglich. Der Kern-Overhauser-Effekt (NOE) zwischen Protonen als das Flüssig-NMR-Arbeitspferd zur Abstandmessung ist aber nur bis fünf Ångström vertrauenswürdig. (4) Nukleobasen enthalten weniger Protonen als Aminosäuren. Wenige Distanzeinschränkungen infolge mangelnder sequentieller Zuordnungen verschlechtern aber die Auflösung von 3D-Strukturmodellen.
Trotz dieser hohen Hürden kommt der Erfolg des COVID-19-NMR-Konsortiums laut seines Koordinators Schwalbe nicht von ungefähr: „Wir waren vorbereitet, weil wir über die letzten fünfzehn Jahre Riboswitches als die natürlichen Rezeptoren niedermolekularer RNA-Liganden untersucht haben. Dafür entwickelten wir eine Reihe von NMR-Experimenten, die anstelle von Protonen Heterokerne wie 13C und 15N detektieren. Das trägt jetzt Früchte.“
Denn 13C/15N-detektierte Experimente profitieren von den verstreuten chemischen Verschiebungen bei gleichzeitig schärferen Linienbreiten der Heterokerne. Während Protonen über 10 ppm verteilt sind, liegen 13C-RNA-Resonanzen zwischen 65 und 170 ppm, können also leichter unterschieden werden. Auch machen Heterokerne zuvor unsichtbare NMR-Resonanzen detektierbar wie etwa NOE-Kreuzpeaks zwischen den Aminogruppen von Nukleobasen und den Protonen von Ribosen.
Da diese Resonanzen sequentielle und intermolekulare Kontakte beschreiben, verfeinern sie die Strukturberechnung von RNA beträchtlich. Zusätzlich reduziert die Kombination mit transversaler Relaxations-optimierter NMR-Spektroskopie (TROSY) die Linienbreiten langsam rotierender RNA. Die NMR-Spezialisten des Konsortiums können deshalb selbst das 472 Nukleotide lange 5‘-Ende und die 337 Nukleotide lange 3‘-UTR in ihrer Gesamtheit anschauen. Ein Review der Arbeitsgruppe von Harald Schwalbe und Boris Fürtig beschreibt die Details, wie RNA-Resonanzen zugeordnet werden können (Chemistry. 26(1): 102-13).
Vor allem überwindet die 13C-Detektion den blinden Fleck der magnetspektroskopischen RNA-Aufklärung. Der Weg dorthin führt indes weiter hinunter in den Kaninchenbau der NMR: Liganden binden meist an dynamische RNA-Abschnitte, also einzelsträngige Regionen in Schleifen und Ausbeulungen. „Diese Bereiche können Protonen-detektierte Experimente schlecht vermessen“, erklärt Schwalbe, “da sich die Imino-Protonen der Nukleobasen mit den Wasser-Protonen im Lösungsmittel in Austausch befinden. Denn im Einzelstrang sind sie ja nicht durch Wasserstoffbrücken geschützt. Dieser Austausch verschlechtert ihre Linienbreiten so sehr, dass wir über Orientierung und Dynamik einzelsträngiger Regionen nur wenig lernen können.“
Warum ist der Protonenaustausch so schädlich für die NMR-Messung? Schwalbe fährt fort: „Auf der NMR-Zeitskala gibt es drei Arten an chemischem Austausch. Er kann langsam sein. Das resultiert in zwei unterschiedlichen Signalen für Zustand A und Zustand B. Er kann schnell sein. Dann zeigt das Spektrum ein gemitteltes NMR-Signal bei der Populations-gewichteten Mitte der chemischen Verschiebungen beider Zustände. Aus beiden Alternativen lernen wir viel über die Dynamik des untersuchten Moleküls. Schlimm ist es aber im intermediären Austauschbereich, denn dort ist das NMR-Signal total verbreitert. Und genau dort befinden sich Imino-Protonen, auch weil sie sich mit dem Lösungsmittel austauschen.“
Diese Problematik umgehen die RNA-Spektroskopiker, indem sie Imino-codierte Magnetisierung auf 13C-Kerne übertragen und dort detektieren. „Wir kommen einfach indirekt an Information über die Imino-Protonen heran. Da RNA-Nukleotide nur über wenige Protonen als Informationsquellen verfügen, verbessert das unsere Strukturmodelle beträchtlich.“
Für die meisten RNA-Elemente von SARS-CoV-2 beobachten die NMRler alle drei Austauschprozesse, vor allem am genomischen 5‘-Ende und für eine Attenuator-Haarnadelstruktur im ribosomalen Frameshift-Segment von ORF1a/b (Nucleic Acids Res. in press). „Positionsgenau detektierte Dynamik erleichtert es natürlich ungemein, Interaktionen zu erkennen“, resümiert Schwalbe und leitet damit zu Phase 2 des Gesamtprojekts über: „Auf Basis der NMR-Datensätze screenen wir Substanzbibliotheken auf Bindung an unsere RNA- und Proteinzielmoleküle. Röntgenkristallographie und Kryo-EM sagen Strukturmodelle ja oft schneller und leichter vorher als NMR. Aber Hunderte Wirkstoffkandidaten können sie unmöglich testen, da sie Kristalle in Gegenwart jedes einzelnen Liganden benötigen. In NMR-Spektren selbst von kombinierten Liganden sehen wir direkt, welche Aminosäuren oder Nukleobasen wie affin binden.“
Wie schaffen die NMRler das? „Wir überprüfen jedes der 18 RNA-Konstrukte mit einer Bibliothek aus 768 Fragmenten, und zwar in Mischungen von je 12 Fragmenten in zwanzigfachem Überschuss“, fasst Schwalbe zusammen. „Pro RNA-Konstrukt benötigen wir für die 64 Spektren der Gesamtbibliothek einen Milliliter einer 200 mikromolaren NMR-Probe, drei Tage Messzeit plus zwei Tage für die Auswertung.“
Erst beträchtliche Vorarbeit macht ihren Ablauf so effizient, bestätigt Schwalbe: „Von allen 768 Fragmenten haben wir eigenständige 1D-Spektren aufgenommen, schon vor der Corona-Pandemie. Wir wissen also, wie chemisch sauber die Fragmente sind und bei welchen chemischen Verschiebungen ihre Signale auftauchen. Dadurch können wir sie ohne Überlapp vereinen. Verschiebt eine RNA ein Fragment-Signal, sehen wir sofort, welches Atom betroffen ist. Zusätzlich verbreitern wir mit bestimmten Pulssequenzen – die einfachsten sind sogenannte T2-Filter – spezifisch die Signale gebundener Fragmente. Reduzierte oder verschwundene Peaks geben dann Aufschluss über die Stärke der RNA-Bindung. Zusätzlich wissen wir, ob sich ein Fragment-Signal infolge seines Zielmoleküls verändert, oder etwa degradiert oder aggregiert, weil sich das Fragment im Puffer des Zielmoleküls nicht löst. Falsch positive Ergebnisse, ein typisches Übel von Screening-Experimenten, verringert das beträchtlich.“
Ihre Chemically-Poised Fragment Library ermöglicht außerdem eine einfache Folgechemie, ergänzt Schwalbe: „In Kooperation mit den RNA-Wirkstoffentwicklern von Saverna Therapeutics verbinden und modifizieren wir erfolgreiche Fragmente und testen auf verbesserte Affinität. Dank unserer NMR-Datensätze für alle 18 RNA-Konstrukte können wir Treffer für ein RNA-Element direkt mit der Spezifität für alle anderen RNA-Elemente abgleichen. Sobald wir die Bindungsstellen der besten Treffer bestimmt haben, titrieren wir sie mit zunehmenden RNA-Mengen. Aus der sukzessiven Signalverschiebung in 2D-HSQC-Experimenten, also NMR-Standardwerkzeugen, lassen sich leicht Dissoziationskonstanten bestimmen. Leider schaffen wir es personell aber nicht, alle Treffer zu verfolgen. Wir mussten fünf der 18 RNA-Elemente anhand ihrer biologischen Relevanz priorisieren. Für die weitere Testung ihrer Ligand-Kandidaten würden wir gern Virologen im COVID-19-NMR-Konsortium begrüßen.“
Werden RNA-Liganden des Konsortiums je bis zur Anwendung reifen? – in Anbetracht von bereits vierhundert SARS-CoV-2-Wirkstoffkandidaten in klinischer Prüfung.
Natürlich fragt sich das auch Schwalbe: „Die langen RNA-Genome von Beta-Coronaviren mutieren allerdings selten. Anti-Corona-Wirkstoffe wären also im Allgemeinen hilfreich. Hätten wir SARS-CoV in der Vergangenheit besser verstanden, existierte vielleicht bereits ein SARS-CoV-2-Therapeutikum. Falls wir also ein wenig zum Verständnis der aktuellen Pandemie beitragen können, sind wir gegen SARS-CoV-3 besser gewappnet – hoffentlich umsonst!“