(11.11.2019) Manchmal beflügeln Widerstände, so hat es den Eindruck. Die noch junge Biotechfirma siTools in Münchens Westen überwand Zweifel, Gründungsstolpersteine und nicht zuletzt technische Schwierigkeiten. Heute stellt sie Forschern Werkzeuge für die RNA-Interferenz zur Verfügung, mit denen man Off-Target-Effekte vernachlässigen kann.
Zwei Tage vor dessen fünfzigsten Geburtstag erwischt Laborjournal Michael Hannus in seiner Wahlheimat Dresden. Nach wie vor steht dort ein Schreibtisch des Firmengründers und Geschäftsführers, obwohl die Firma doch in Martinsried bei München lokalisiert ist. Wieso das? Der Reihe nach...
Der gebürtige Münchner Hannus studierte in Regensburg Biologie, bevor er am European Molecular Biology Laboratory (EMBL) in Heidelberg promovierte. Nach seiner Doktorarbeit im Jahr 2001 heuerte er bei Cenix Biocience an. Das damalige Start-up gründete sich 1999 am EMBL aus und galt mit seiner siRNA-Technologie als Vorreiter der RNA-Interferenz (RNAi). Mittels künstlich hergestellter small interfering RNA, siRNA, lassen sich gezielt mRNA-Moleküle abfangen und somit deren Translation verhindern. So können Forscher Gene zeitweise ausschalten, mehr oder weniger zielgerichtet.
Für die Entdeckung des RNAi-Mechanismus erhielten die US-Amerikaner Andrew Fire und Craig Mello 2006 den Nobelpreis für Medizin oder Physiologie. Zu diesem Zeitpunkt war Cenix bereits von Heidelberg nach Dresden umgezogen, wo sie auch heute noch firmiert. Mit ihr zog auch Hannus nach Dresden, forschte, entwickelte und interferierte.
„Damals dachte man wirklich, mit RNAi lässt sich alles kurieren. Forscher und Industrie waren ganz wild darauf“, sagt Hannus. Aber natürlich blieb auch Cenix nicht von den inzwischen wohlbekannten und gut untersuchten Off-Target-Effekten verschont, an denen schon viele RNAi-Projekte kläglich scheiterten. Denn so einfach lassen sich Gene nun auch nicht herunterregeln. „Inzwischen weiß jeder, dass siRNAs recht unspezifisch sind, denn durch microRNA-Effekte trifft jedes interferierende RNA-Molekül eben nicht nur das Ziel-Gen, sondern auch viele andere Gen-Transkripte.“ Die Folge: Nicht vorhersehbare Nebenwirkungen; und Zusammenhänge, wo keine sind.
Im Jahr 2007 kam Hannus eine Idee, wie sich das ändern ließe. Seine Chefs bei Cenix wollten davon allerdings nichts wissen. Also einfach weitermachen wie bisher? Das wollte Michael Hannus nicht. Er entschied, seine Idee weiterzuverfolgen – zur Not auch allein.
Allein war er dann doch nicht, denn Hannus bekam Schützenhilfe von seinem Bruder Stefan. Dieser – ebenfalls Wissenschaftler – hatte sich just 2008 mit einer eigenen Biotechfirma ins Gründergetümmel gestürzt: Dessen Münchner Intana Bioscience unterstützt mit ihrer proprietären FCCS-Technologie (Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy) Unternehmen bei der Wirkstoffentwicklung. Kurzerhand stellte Intana Michael Hannus Labor und Pipette zur Verfügung, sodass er seine Theorie überprüfen – und verifizieren – konnte (Nucleic Acids Res. 42(12): 8049-61). Gemeinsam mit dem Regensburger RNA-Biochemiker Gunter Meister sowie mit einem Exist-Gründungsstipendium in der Tasche gründete Hannus im Jahr 2013 seine Firma siTools.
Was war aber diese spektakuläre Idee, mit denen Hannus Off-Target-Effekten begegnen wollte? Dazu muss man zunächst den Grund für diese unerwünschten RNAi-Nebenwirkungen verstehen. Jedes siRNA-Molekül bindet spezifisch an die mRNA seines Ziel-Gens. Gleichzeitig haben sie aber auch die dumme Angewohnheit, mal hier, mal dort mRNAs des gesamten Genoms zu binden.
Schuld daran ist insbesondere die sogenannte Seed-Sequenz, eine Sechser-Basenfolge im spezifischen Abschnitt der siRNA. „Jede einzelne siRNA hat ihren eigenen Satz an unspezifischen Effekten, aber der ist für jede siRNA anders“, fasst Hannus zusammen. Und genau dort liegt die Chance der Wissenschaftler: Wenn man nun viele siRNAs gegen ein und dasselbe Zielgen miteinander vermischt, dann konzentriert sich in der Mischung der gewünschte On-Target-Effekt auf, denn jedes dieser Moleküle bindet zuverlässig die gewünschte mRNA. Die unspezifischen Nebenwirkungen jedoch schlagen zwar weiterhin mal hier, mal dort zu – in der Mischung verliert diese Unspezifität jeder einzelnen siRNA aber an Bedeutung, der Off-Target-Effekt verdünnt sich gewissermaßen heraus. Die Lösung ist also eigentlich recht simpel: Man verwendet nicht nur eine einzelne siRNA-Sequenz, sondern eine Mischung aus mehreren unterschiedlichen – einen sogenannten siRNA-Pool, kurz siPool.
Die Idee der siRNA-Mischung, so betont Hannus, sei aber nicht seine gewesen. Der damalige Marktführer Dharmacon bot bereits Pools an. Allerdings enthielten die nur vier oder fünf siRNAs, zu wenig für einen ordentlichen Verdünnungseffekt. Eine Mischung aus dreißig siRNAs, wie siTools sie anbietet, sei damals jedoch mit der bisherigen siRNA-Herstellungsmethode, der chemischen RNA-Synthese, unbezahlbar gewesen. Der eigentliche Coup ist deshalb der Herstellungsprozess der siPools.
Zunächst einmal muss ein Rechnergehirn ran, denn der Bauplan für geeignete siRNA-Sequenzen entsteht in silico. „Die dreißig siRNAs müssen nach Möglichkeit alle Transkripte des Zielgens treffen“, fasst Hannus die erste und wichtigste Herausforderung an das bioinformatische Design der Oligos zusammen. Zudem muss der Seed-Bereich optimalerweise für alle siRNAs unterschiedlich sein, denn – wir erinnern uns – diese kurze Basensequenz des Antisense-Stranges ist verantwortlich für die Off-Target-Effekte. Wenngleich der Algorithmus zuverlässig arbeitet, schauen Hannus und seine Kollegen zum Schluss oft noch einmal über die vorgeschlagenen Sequenzen, korrigieren hier und da ein wenig: „Für einige Entscheidungen braucht es eben einen erfahrenen Bioinformatiker.“
Die auserkorenen siRNA-Sequenzen werden nun zu einer langen Sequenz verquickt, nur getrennt durch kurze Linker. Diese künstlichen Gene sind etwa 750 Basen lang und werden nun extern als DNA-Strang synthetisiert, je eine Sense- und eine Antisense-Sequenz.
Das ist auch heute noch der kostenintensivste Schritt in der siRNA-Herstellung, und daran wäre die siTools-Idee in ihren Anfängen auch beinahe gescheitert. Hannus erinnert sich: „Als wir 2007 angefangen haben, hat die Synthese einer einzigen Base künstlicher DNA-Sequenz fünfzig Cent gekostet. Da kann man sich den Preis für 1.500 Basen ausrechnen, das hätte so niemals funktioniert.“ Aber der technologischen Entwicklung sei Dank, fielen die Basenpreise stetig und liegen laut Hannus inzwischen bei unter zehn Cent. Glück oder richtiger Riecher? Vermutlich eine Mischung aus beidem.
Um aus DNA RNA zu machen, werden die eingekauften DNA-Stränge mittels T7-Polymerase transkribiert. Die enzymatische In-vitro-Transkription erzeugt eine große Menge an RNA und ist um Größenordnungen günstiger als eine direkte chemische Herstellung. Die RNA-Einzelstränge werden zu einem langen RNA-Doppelstrang hybridisiert, auf dem die siRNAs aufgereiht wie auf einer Perlenschnur liegen.
Aufgrund abweichender Linker-Sequenzen zwischen den eigentlichen siRNA-Sequenzen passen die gegenläufigen Stränge nicht exakt aufeinander, es bleiben nicht-hybridisierte Lücken. Diese sind Einfallstore für einen enzymatischen Verdau der langen RNA-Moleküle. Das Resultat ist eine äquimolare Mischung perfekter kleiner siRNAs, die nur noch aufgereinigt werden müssen. Dies geschieht über – man höre und staune – PAGE, also Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
„Alle haben gesagt: Das könnt ihr nicht machen, das funktioniert bei hohem Durchsatz nicht“, so Hannus über die im Vorfeld geäußerten Bedenken. „Wir haben superdicke Gele entwickelt und gezeigt: Doch, es funktioniert! Man braucht keine teuren Geräte – nur ein paar Glasplatten, eine Stromquelle und ein Skalpell, um die RNA auszuschneiden. So erreichen wir eine hervorragende Aufreinigung bei gleichzeitig ausreichendem Durchsatz.“ Hannus macht es ganz offensichtlich Spaß, die ewigen Zweifler immer wieder vom Gegenteil zu überzeugen. Trotzdem stellt siTools nach und nach auf HPLC-Reinigung um, da die Auftragslage entsprechend gut ist.
„Aufgrund der mangelnden Spezifität ist RNAi ein bisschen in Verruf geraten, die RNAi-Welle ist merkbar abgeebbt“, sagt Hannus. Und dann ist da noch CRISPR. Viele, die früher siRNA nutzten, seien jetzt auf CRISPR/Cas umgestiegen, so Hannus, obwohl das ja zwei völlig unterschiedliche Methoden seien. Die Nuklease schneidet DNA irreversibel, es setzen Kompensationseffekte ein, während RNA-Interferenz eine transiente, partielle Expressionsreduktion eines Gens ist.
Bei siTools steigen die siRNA-Verkäufe zumindest weiterhin stetig, berichtet der Firmenchef zufrieden. Es sind kleinere und mittelgroße Biotechfirmen, aber auch große Pharmaunternehmen, die ihre siRNAs bei dem kleinen Münchner Unternehmen mit seinen sechs Mitarbeitern kaufen.
Mittlerweile hat siTools weitere Werkzeuge auf den Markt gebracht. Zum Beispiel raPool, eine komplexe Mischung biotinylierter DNA-Oligos, mit denen der Kunde long non-coding RNA (lncRNA) affinitätsaufreinigen kann, um zu schauen, was so an Protein, DNA oder RNA daran hängt. Genau das Gegenteil macht riboPool, denn es entfernt störende ribosomale RNA aus einem RNA-Gemisch. Derart depletiert kann dieses mittels RNA-seq, also Next-Generation-RNA-Sequencing, charakterisiert werden.
Die Produkte kommen gut an, sodass siTools von Anbeginn schnell ohne Investoren ausgekommen ist. Über den Verkauf ihrer Pools und Dienstleistungen finanziert sich die Firma selbst. Hin und wieder fließen zusätzlich Forschungsfördergelder, etwa der Bayrischen Forschungsstiftung, die wissenschaftliche Projekte und Kooperationen fördert.
Der Kampfgeist hat sich also gelohnt und ist im Hause Hannus offenbar Programm. Nicht nur Michael hat seine Firma gegen Widerstände und Zweifler bis heute zu einem erfolgreichen kleinen Unternehmen aufgebaut. Sein Bruder Stefan ist Anfang des Jahres über die verschneiten Alpen Richtung Peking aufgebrochen – per Rad. Ende September hatte er sein Ziel erreicht und ist bereits wieder auf dem Rückweg.
Michael Hannus dazu: „Stefan hat einfach mal eine Pause gebraucht. Wir haben 1984 für ein Jahr in Peking gewohnt. Es war so ein Kindheitstraum, wir wollten immer mal durch China radeln. Und Stefan hat es jetzt kurz entschlossen einfach durchgezogen.“ So sind sie eben, die Hannus-Brüder.
Warum die Gründungsgeschichte von siTools fernab von politischem Wunschdenken stattfand und was gründungswillige Wissenschaftler außer ihrer Knallertechnologie sonst noch mitbringen sollten, erklärt siTools-Geschäftsführer Michael Hannus auf Laborjournal online (14.11.19).