(08.05.2020) Organoide geraten weiter in den Fokus der pharmazeutischen Industrie, etwa für Toxizitätstests, Wirkstoff-Screenings oder Krankheitsmodelle. Die Idee: Humane Organmodelle spiegeln die In-vivo-Situation zuverlässiger wider als 2D-Zellkultur oder Tiermodelle. Darauf haben sich auch Biotech-Firmen und Laborzulieferer eingestellt und versorgen die Forschenden mit allem, was sie für die ordentliche 3D-Zellkultur benötigen.
Anfang April zeigte das Institut für Molekulare Biotechnologie der Österreichischen Akademie der Wissenschaften (IMBA) mithilfe von Blutgefäß- und Nieren-Organoiden, dass humanes rekombinantes Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 (hrACE2) eine Infektion mit SARS-CoV-2 hemmt. Besser bekannt ist hrACE2 als APN01 des Wiener Biotech-Unternehmens Apeiron, welches als heißer Kandidat für einen Anti-COVID-19-Wirkstoff gilt (Laborjournal 4/2020: 42-5). Selbst bei der aktuellen Pandemie helfen Organoide also inzwischen.
Organoide sind eine selbstorganisierende Miniversion des jeweiligen Organs und damit mehr als eine Ansammlung organspezifischer Zelltypen. Unterstützt durch eine 3D-Matrix sowie Wachstumsfaktoren differenzieren Stammzellen oder organtypische Vorläuferzellen (Primärzellen) zu komplexen, hochorganisierten 3D-Strukturen, die optimalerweise eine Organfunktionalität aufweisen. Deren Phänotyp, charakterisiert durch eine Gewebekomplexität höherer Ordnung, unterscheidet Organoide von den ebenfalls dreidimensional organisierten Sphäroiden, die meist kugelig aggregierte, multizelluläre Tumormodelle oder einfache Zell-Cluster aus beispielsweise Hepatozyten oder Neuronen sind.
Dass Organoide in der Pharmaindustrie bisher eher sparsam eingesetzt werden, liegt oft am Geld. Denn die 3D-Zellkultur ist aufwendiger und teurer als standardisierte, skalierbare und hochdurchsatzfähige Methoden der 2D-Zellkultur. Allerdings sind zweidimensionale Zellteppiche auf harten Plastikoberflächen weit entfernt von einer physiologischen Situation oder gar einem menschlichen Organismus. Die Zukunft gehört also den Mini-Organen.
Wenig überraschend bieten die Großen unter den Laborzulieferern daher so einiges für 3D-Zellkulturen. Sigma-Aldrich/Merck (USA) zum Beispiel hat Medien, Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Organoid-Matrices im Sortiment – und natürlich Plastikwaren jeglicher Couleur. Als Schmankerl finden sich „Organoids on Demand“ (Darm-Organoide) sowie iPS-Zelllinien (induzierte pluripotente Stammzelllinien). Da will auch Thermo Fisher Scientific (USA) nicht hinterherhinken und wirbt ebenfalls mit passender Plastikware, Hepatozyten-Sphäroiden sowie extrazellulärer Matrix für die Organoid-Kultivierung.
Aber auch kleinere Firmen halten mit. Neben zahlreichen zellbiologischen und biochemischen Agenzien gibt es etwa bei PELObiotech (Martinsried) so ziemlich alles, was das 3D-Forscherherz begehrt. „In erster Linie sind wir ein Medienentwickler und -produzent“, sagt Lothar Steeb, PELObiotechs CEO und CSO in Personalunion – und erklärt weiter: „Aber durch unser weltweites Experten-Netzwerk sind wir nah am Puls der Forschung und Entwicklung, sodass wir stets neue Produkte rund um die Primär- und 3D-Zellkultur anbieten können.“
Als Distributor stellt PELObiotech diese Produkte dann den hauptsächlich in der Grundlagenforschung tätigen Kunden in Deutschland zur Verfügung. Beispiel gefällig? „Wir haben die Firma Xylyx aufgetan, die organspezifische Gele und Coating-Zusammensetzungen anbieten“, konkretisiert der Biologe. Laut Steeb würden sie direkt aus Organen zellfrei Matrixproteine isolieren, sodass diese Zusammensetzung exakt dem entspräche, was die Zellen im Organ vorfinden würden. „Da fühlt sich eine Zelle natürlich heimischer als auf Beschichtungen oder in Hydrogelen mit Gelatine, Kollagen oder Fibronectin.“
PELObiotechs 3D-Produktportfolio umfasst aber weit mehr: Hydrogele und Scaffolds, Sphäroid-, organtypische und Organoid-Modelle sowie 3D-kompatible Perfusions- oder Flusssysteme. Damit lassen sich beispielsweise durch eine Membran getrennte Zelltypen co-kultivieren. Und natürlich hat PELObiotech auch Medien.
Ein wahres 3D-Eldorado ist auch die Troisdorfer Biotech-Firma CellSystems. Neben diversen Hydrogelen finden sich dort zahlreiche Matrix-Produkte für die 3D-Zellkultur wie Fibronectin, Kollagenschwämme, Adhäsionsmoleküle oder Hyaluron-Gele. Organtypische 3D-Zellkulturmodelle rund um die menschliche Haut gibt es ebenso wie „Tinte“ für 3D-Bioprinting: Licht- und Wärme-induzierte Vernetzung auf der Basis von Kollagen, Gelatine oder Hyaluronsäure, dazu mit unterschiedlicher Steifigkeit – jeder Zelltyp sollte dort sein passendes „Gerüst“ finden.
Einen 3D-Schwerpunkt zeigt auch der technische Laborausstatter Omni Life Science (OLS) aus Bremen. Ob Zellzählung und -analyse, Kultivierung oder Life Cell Imaging – Zellbiologen mit Organoid-Faible dürften hier fündig werden. Dabei entwickeln die Bremer nicht nur selbst, sondern nehmen auch interessante Produkte anderer Hersteller in ihr Portfolio auf. X-Clarity der Firma Logos Biosystems (Südkorea) etwa ermöglicht ein Hydrogel-unterstütztes Tissue Clearing, um auch große Organoide oder Mikrogewebe lichtmikroskopisch betrachten zu können, ohne dass störende Lipide den kritischen Blick trüben.
Neuestes Schätzchen der OLS-eigenen Entwicklungs-Pipeline ist der Benchtop-Bioreaktor und -Inkubator CERO, in dem sich bis zu vier 50 ml große CERO Tubes separat drehen und definieren lassen: Rotations-Geschwindigkeit, Dauer der Kultur, Volumen des Mediums, inkubierter Zelltyp – über ein Display stellt der Experimentator unterschiedliche Parameter für jede Position ein. „CERO ist ein geschlossenes, eigenständiges System für 3D-Suspensionskulturen,“ fasst OLS-Verkaufsleiter Andreas Friese zusammen. Warum solch ein System besser ist als die herkömmliche Inkubation statischer 2D- oder 3D-Systeme, erklärt Produktmanager Amir Keric: „Durch eine bilaterale Rotation schweben Zellen oder 3D-Kulturen quasi im Medium, und durch die Homogenisierungs-Lamellen an den Gefäßrändern wird die gesamte Kultur ständig und sanft durchmischt.“
Das verbessere den Metabolit- und Gasaustausch und erlaube Langzeitkulturen insbesondere von 3D-Strukturen wie Sphäroiden oder Organoiden, sind sich beide einig. Die Folge: „Im Vergleich etwa zur Hanging-Drop-Methode beobachten wir eine effizientere Differenzierung“, erläutert Keric. Und Friese ergänzt: „Größere 3D-Strukturen weisen zudem, wenn überhaupt, erst deutlich später nekrotische Bereiche auf, so dass wir reifere Sphäroide, Organoide oder auch Gewebekulturen am Leben erhalten können.“ Da sich zudem mehrere Tausend 3D-Strukturen ein Tube teilen, sind sie alle den gleichen Bedingungen ausgesetzt: Medium-Zusätze, pH-Wert, Temperatur. Das sei viel Biomasse, die laut Keric eine sehr geringe Variation zwischen den Klonen aufweise. Hohe Reproduzierbarkeit? Das hören Forscher gern.
Andere Firmen stellen gar selbst Organoide her und bieten sie auf dem Biotech-Markt feil. In einem Kooperationsprojekt mit der Hochschule Mannheim entwickelt das Biotech-Unternehmen BRAIN AG (Zwingenberg) beispielsweise Geschmacksknospen-Organoide – ein Konglomerat aus Sinnes- und Gerüstzellen zur Testung sogenannter Nutrazeutika, also funktioneller Nahrungsmittel. Auf Dauer will BRAIN nicht mehr auf menschliche, und damit subjektive, Geschmackstester angewiesen sein. Die „schmeckenden“ Organoide sollen als standardisiertes In-vitro-Testsystem die menschlichen Zungen ersetzen. Eine tatsächliche Anwendung liegt aber wohl eher in ferner als naher Zukunft.
Weiter sind dagegen die in Schlieren bei Zürich beheimateten Biotechnologen von InSphero, die organtypische 3D-Modelle anbieten. Gerne erklären sie die Vorteile ihrer 3D InSight-Plattform: „Hepatozyten beispielsweise verlieren in der 2D-Zellkultur ihre Leberzell-spezifische Funktionalität nach drei bis vier Tagen“, sagt CEO und Firmen-Mitgründer Jan Lichtenberg. „Humane Primärzellen vom gleichen Donor als dreidimensionales Gewebe kultiviert, also als Sphäroid oder Organoid, können wir hingegen sechzig bis siebzig Tage funktionell erhalten.“ Grund sei, dass die Zellen ihren eigenen Differenzierungsdruck aufrechterhalten – induziert durch stärker ausgebildete Zell-Zell-Kontakte, aber auch physikalische Komponenten oder chemische Signale wie Sauerstoff- oder Metabolitgradienten.
Die Technologie 3D Select sorgt zudem dafür, dass alle Mikrogewebe gleich aufgebaut sind. „Während der Isolation vom Donor-Organ oder der Lagerung werden immer wieder Zellen geschädigt und bauen sich nachher nicht gut in ein Gewebe ein“, sagt Lichtenberg. Adhäsions-kompromittiert nennt er solche Zellen, die im schlimmsten Fall apoptotisch sind und Nachbarzellen mit ins Unglück reißen. Deshalb werden sie aus dem Zellgemisch herausgefischt. Die resultierenden Mikrogewebe sind auf diese Weise von gleichbleibender Qualität und deutlich funktionaler als ohne 3D Select. „Viel wichtiger ist aber, dass wir so aus praktisch jedem Donor und jedem Zelltyp 3D-Modelle erzeugen können“, so Lichtenberg weiter.
Von einer solchen Erfolgsquote profitieren auch die Kunden aus Pharma und Biotech, für die die Zürcher fertig charakterisierte und perfekt konstruierte Mikrogewebe um die ganze Welt schicken. Dafür hat InSphero sogar extra einen pfiffigen Versandkarton entworfen. In einer Kugel aus stoßsicherem Styropor lagert wohltemperiert die wertvolle Fracht in Mikrotiterplatten. Diese Kugel, am Schwerpunkt mit einem Gewicht beschwert, wabert auf einem dünnen Flüssigkeitsfilm in einem größeren Styroporgebilde. Egal wie sich nun der Versandkarton dreht oder wendet, die innenliegende Kugel richtet sich blitzschnell wieder aus und die Zellen bleiben stets in aufrechter Position.
Anwendungen finden die Tumor-Modelle, Mini-Lebern oder Islets (Organoide der Langerhansschen Inseln aus dem Pankreas) von InSphero beispielsweise in Substanzsicherheits- und Toxizitätstests sowie bei der Erforschung von onkologischen und metabolischen Krankheiten wie Diabetes Typ 1 und 2, NASH (Nicht-alkoholische Steatohepatitis) oder NAFLD (Non-alcoholic fatty liver disease).
Für komplexere Fragestellungen gibt es das Akura-Flow-System, denn damit lässt sich das Zusammenspiel mehrerer Organe simulieren. Auf einem Mikrochip können bis zu acht Mikrogewebe parallel kultiviert und über Kanäle miteinander verbunden werden. „Das Chemotherapeutikum Cyclophosphamid muss erst in der Leber gespalten werden, um den eigentlich cytostatischen Metaboliten freizusetzen“, nennt Lichtenberg ein Anwendungsbeispiel. Wird Tumorgewebe allein auf dem Chip mit Cyclophosphamid behandelt, wächst dieses weiter. Befindet sich in einer der anderen Kulturkämmerchen jedoch ein Leber-Organoid, stagniert das Tumorwachstum. „Damit sind wir in der Lage, Vorhersagen über mögliche Wirkstoff-Nebenwirkungen zu treffen, bevor man ins Tier oder in klinische Studien geht“, sagt Lichtenberg.
Auf „Minihirne“ hingegen konzentriert sich a:head bio. „Unsere cerebralen Organoide sind 3D-Kulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen, die zunächst aus Blutzellen reprogrammiert werden und sich dann über verschiedene Entwicklungsstufen zu einem komplexen, kortikalen Gehirngewebe organisieren“, erzählt Oliver Szolar, Biotechnologe und CEO des erst 2019 gegründeten Wiener Biotech-Startups. Szolar spezifiziert: „Das Gewebe entwickelt sich aus den Stammzellen in eine korrekte dreidimensionale Architektur, mit entsprechendem Brain Patterning – von Vorläuferzellen zu fertigen Neuronen und verschiedenen sogenannten Supportive Cells.“
Vergleichbar sei ein solches Organoid mit dem Hirngewebe eines Fötus in einer frühen Schwangerschaftsphase. Wohin sich die Zellen differenzieren sollen, erfahren sie über einen Cocktail an Wachstumsfaktoren im Zellkulturmedium. Die Technologie stammt aus der Arbeitsgruppe von Jürgen Knoblich, Wissenschaftsdirektor des IMBA in Wien, sowie seiner ehemaligen Mitarbeiterin Madeline Lancaster, die inzwischen Gruppenleiterin am Medical Research Council (MRC) Laboratory of Molecular Biology im englischen Cambridge ist. Beide sind Firmen-Mitgründer und als wissenschaftliche Berater bei a:head bio aktiv.
Mit ihren Gehirnmodellen wollen die Wiener Forscher verschiedene Erkrankungen des zentralen Nervensystems simulieren. „Mit Material von Epilepsie-Patienten können wir beispielsweise cerebrale Organoide aufbauen, die sich von Organoiden von Nicht-Epileptikern unterscheiden“, sagt Szolar. Ein solches Krankheitsmodell ließe sich für die pharmakologische Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Epilepsie verwenden. Das sei die Zukunft der Medikamentenentwicklung, ist der a:head bio-Chef sicher: „Wir haben hier das derzeit komplexeste humane Gehirnmodell für die präklinische Entwicklung zur Verfügung.“
Damit Organoide sich in die gewünschte Form entwickeln, benötigen sie oftmals etwas Stütze. Kaum wegzudenken aus der 3D-Zellkultur sind deshalb Hydrogele, also wasserunlösliche aber wasserspeichernde Polymer-Netzwerke, die aufgrund ihrer Gelee-artigen Struktur wachsenden Zellen Halt in der dritten Dimension bieten. Statt auf hartem Plastik in 2D betten sich Zellen in 3D-Kulturen auf Matrices, die in Steifigkeit und Konsistenz natürlichen Geweben nachempfunden sind. Hydrogelplättchen mit unterschiedlichem Durchmesser, mit Kollagen oder Peptiden und sogar mit organtypischer Umgebung wie etwa für Cornea-Modelle gibt es bei Primacyt in Schwerin, ebenso wie diverse Medien und andere 3D-relevante Substanzen.
Sicherlich bekanntestes Hydrogel-Beispiel ist das von Corning Life Sciences (USA) vertriebene Matrigel, ein von murinen Krebszellen sekretiertes Molekülgemisch, welches die extrazelluläre Matrix von Geweben imitiert. Neben Strukturproteinen wie Laminin oder Kollagen finden sich in dieser Matrix zahlreiche Wachstumsfaktoren. Und genau das ist der Haken: Inhaltsstoffe und deren Mengen variieren sogar von Charge zu Charge. Für Experimente, in denen Organoide zu definierten Mikrogeweben differenzieren sollen, ist das ungünstig.
Wie man die Zellen in welches Hydrogel bettet, entscheidet oft über den Erfolg der 3D-Zellkultur. Illustr.: Adv. Science News
Um solche Unsicherheiten zu umgehen, hat Cellendes ihre 3-D Life Biomimetic Hydrogels entwickelt. „Unser Ziel war es, Hydrogele für die dreidimensionale Zellkultur herzustellen, die völlig Zell-inert sind und praktisch wie ein weißes Blatt beschrieben werden können“, erläutert Brigitte Angres, die Cellendes gemeinsam mit Helmut Wurst leitet. Die beiden Geschäftsführer haben das Reutlinger Unternehmen 2009 als Spin-off der Universität Tübingen gegründet.
Die Cellendes-Hydrogele sind ein Zweikomponenten-System aus Polymeren, die erst bei Kontakt gelieren. Eine Zellsuspension wird zunächst mit der ersten flüssigen Komponente vermischt, bevor der Vernetzer hinzugegeben wird und die Suppe fest wird. „Das kann in Sekunden gehen, während wir bei anderen Hydrogelen eine Chemie anwenden, bei der die Gelierung mehr Zeit benötigt“, erläutert Angres. Das ist beispielsweise wichtig, wenn man das hochtransparente Hydrogel samt Zellen in Mikrokanäle einfüllen möchte.
Je nach Forschungsansatz und Zellen können die Kunden die Blanko-Hydrogele so modifizieren, dass sie für ihre Experimente eine perfekte Matrix bieten. Dazu gehören die Zugabe von definierten Adhäsionspeptiden wie etwa RGD-Peptiden aus Fibronectin – oder eben spezifische Wachstumsfaktoren. Für Pankreas-Organoide sind dies unter Umständen andere als für Leber-Organoide.
Ein weiterer Clou: Der Hydrogel-Vernetzer enthält eine Matrixmetalloprotease (MMP)-Spaltstelle. Exprimiert eine Zelle nun MMPs, macht das Hydrogel bereitwillig Platz für Zellwanderungen oder -ausläufer.
Zudem arbeiten die Forscher von Cellendes in einem EU-Projekt gerade an der Entwicklung von photo-induzierbaren Hydrogelen, die für zellkompatible 3D-Druck-Verfahren genutzt werden können.
Mithilfe ihrer Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) macht das Wiener Startup UpNano bereits genau dies (siehe Laborjournal 03/2020: 50-1). Der Bio-Printer NanoOne druckt kleinste Bauteile etwa für Mikrooptiken, indem er die licht-sensitive Matrix Submikrometer-genau nur im Fokuspunkt eines Ultrakurzpuls-Lasers aushärtet. Damit sich auch Zellen in einem derart hergestellten Gerüst wohlfühlen, haben die Jungunternehmer von UpNano das Gelatine-basierte, mit einem passenden Photoindikator vernetzte Hydrogel UpBio entwickelt.
Ein ähnliches Druckmaterial, ebenfalls 2PP-geeignet, gibt es bei Nanoscribe (Eggenstein-Leopoldshafen). IP-Visio ist ein Fotolack auf Acrylatbasis, der laut Herstellerwebseite durch vernachlässigbare Autofluoreszenz glänzt und sich somit für mikroskopische Anwendungen eignet. Die passenden 3D-Drucker, das Lithografiesystem Quantum X sowie GT2, gibt es praktischerweise auch gleich bei Nanoscribe zu kaufen.
Ob mit oder ohne Hydrogel und Gerüst – auf irgendeiner Oberfläche beziehungsweise in irgendeiner Art von Gefäß müssen alle Zellen wachsen. Lonza (Basel) präsentiert hierfür ihre RAFT-Reihe aus Zellkulturplatten und Kits zur Kultivierung von 3D-Zellkulturen. Damit etwa Sphäroide nicht an einer Plastikoberfläche adhärieren, gibt es inerte Zellkulturplatten, beispielsweise von Ibidi (Gräfeling). Praktischerweise kann der Forscher mit denen auch direkt hochauflösend mikroskopieren.
Zellabweisende Oberflächen für Sphäroid-Kulturen oder 3D-Kulturen in Hydrogelen bietet auch Greiner (Kremsmünster, Österreich) mit seinen CELLSTAR Zellkulturgefäßen an. Forcieren kann der Experimentator die Zellaggregation mit NanoShuttle, ebenfalls von Greiner. Magnetische Nanopartikel werden an der Oberfläche der Zelle angelagert, wodurch sie in Anwesenheit eines Magneten in die gewünschte Form gezwängt werden.
Es geht aber noch anders: Die Statarrays von 300MICRONS sehen erst einmal aus wie eine übliche 96-Well-Platte. Der Plattenboden aber hat es in sich. „Die Statarrays haben hochtransparente dünne Folienböden mit regelmäßigen Anordnungen von Mikro-Vertiefungen, auch Kavitäten genannt, von 300, 500 oder 800 Mikrometer Durchmesser“, erklärt Stefan Giselbrecht, CEO von 300MICRONS. Gemeinsam mit Co-Geschäftsführer Roman Truckenmüller sowie dem inzwischen ausgeschiedenen Eric Gottwald gründete er die Firma 2015 aus dem Karlsruhe Institut für Technologie (KIT) aus. Um die dünnen Kunststofffolien bearbeiten zu können, haben die Forscher ein spezielles thermisches Formverfahren entwickelt, bei dem unter Hitze und Druck die Mikro-Vertiefungen in die Folie gepresst werden.
In diese kleinen Vertiefungen werden Zellen gesät und aggregieren – falls erwünscht – zu freischwimmenden Sphäroiden oder bilden Organoide. Beschichtet mit beispielsweise Kollagen oder Fibronectin adhärieren Zellen aber auch an der Kavitätenwand und füllen so nach und nach die gesamte Vertiefung aus. Dabei erlauben die dünnen und hochtransparenten Folienstrukturen jederzeit hochauflösende Mikroskopie und auch Lebendzell-Mikroskopie.
Genauso gut kann der Forscher aber auch Hydrogele in den Platten verwenden, wenn es das Experiment erfordert. Aber: „Die optischen Eigenschaften von Hydrogelen wie Matrigel sind meistens nicht sonderlich gut, sodass die Mikroskopierbarkeit von Organoiden unter Umständen eingeschränkt ist“, sagt Giselbrecht. Außerdem seien frei in Medium schwimmende 3D-Zellkulturen leichter zugänglich und die Zufuhr von Substanzen besser kontrollierbar als bei in Hydrogel eingebetteten. Wenn komplexe Organoide aber beispielsweise Komponenten der Basalmembran benötigten, so Giselbrecht, sei die Kombination von Statarrays mit Hydrogelen natürlich möglich.
So sind über Folienbeschichtung, aber auch Mediums-Zusätze oder Zelltyp verschiedenste Fragestellungen darstellbar. Durch das gängige Mikrotiterplatten-Format sind die statischen Arrays von 300MICRONS hochdurchsatzkompatibel – sicher auch eine gute Voraussetzung für den Einsatz in Wirkstoffentwicklung und Toxizitättestung der pharmazeutischen Industrie. Aber die Karlsruher haben noch weitere modulare wie auch dynamische Kultursysteme im Angebot. Über poröse Polycarbonat-Folien ist beispielsweise eine kontinuierliche Versorgung mit Nährmedium möglich, was unter Umständen längere Kulturzeiten erlaubt. Und auf Kundenwunsch entwickelt 300MICRONS auch spezielle Formate.
Möchte der Forscher nun seine Organoide oder sonstigen 3D-Zellkonstrukte anschauen, findet er auch hierfür passende Lösungen. CENIBRA (Bramsche) etwa vertreibt das Benchtop-Cytometer CQ1 (Hersteller: Yokogawa Electric Corporation) für konfokales Imaging auch größerer 3D-Strukturen. Die THUNDER-Imaging-Systeme von Leica Microsystems (Wetzlar) hingegen haben eine spezielle Computational-Clearing-Funktion, die auch bei größeren Objekten störendes Hintergrundrauschen herausrechnet.
Bleibt zum Schluss, dass dieser Biotech-Rundumschlag sicherlich keinen Anspruch auf Vollständigkeit erhebt. Für einen vorläufigen Überblick über das, was der Markt gerade für Organoid-Forscher hergibt, sollte es dennoch reichen.