Tipp 133:
Automatisch Komplexe kriegen - Expression von Multiproteinkomplexen

Einzelne Proteine in E. coli zu exprimieren ist für Molekularbiologen Routine. Mehrere Proteine gleichzeitig herzustellen dagegen eine endlose Sisyphos Arbeit – es sei denn man kennt ein cleveres, automatisches Expressionsystem.

Die rasant steigende Zahl entschlüsselter Genome ist für Genomiker und Proteomiker Segen und Fluch zugleich. Auf der einen Seite erhalten sie Zugang zu immer umfangreicheren Sequenzdaten. Auf der anderen Seite wächst ihnen die Analyse der von den sequenzierten Genen kodierten Proteine langsam über den Kopf.

Eine der größten Herausforderungen für die Forscher sind die gegenseitigen Wechselwirkungen der Proteinmoleküle in der Zelle. Proteine führen ihre Aufgaben zumeist nicht isoliert voneinander aus. Nahezu alle lebenswichtigen Vorgänge in der Zelle werden von komplizierten Proteinmaschinen gesteuert, die jeweils aus zehn oder mehr Einzelbausteinen bestehen.

Die detaillierte Analyse der Struktur und Funktion dieser Proteinkomplexe ist Grundvoraussetzung für das Verständnis der zellulären Vorgänge. Bis auf wenige Ausnahmen liegen die meisten wichtigen Proteinkomplexe jedoch in außerordentlich geringen Mengen in der Zelle vor. Ihre Aufreinigung aus Zellmaterial, etwa aus menschlichem Gewebe, ist daher schwierig oder gar nicht möglich.

Ein Ausweg ist die Herstellung dieser Protein-Komplexe in speziellen Wirtszellen durch rekombinante Techniken. Einzelne Proteine oder kleine, einfache Komplexe mit zwei oder drei Komponenten lassen sich auf diese Weise noch relativ einfach herstellen. Bei sehr großen Proteinkomplexen mit vielen Untereinheiten wächst der experimentelle Aufwand aber exorbitant an, und ist mit herkömmlichen Methoden praktisch nicht mehr zu bewältigen.

Unser Forschungsteam aus Mitarbeitern des Europäischen Molekularbiologie-Labors (EMBL) aus Grenoble, Frankreich, und dem Paul Scherrer Institut (PSI) in Villigen, Schweiz hat deshalb das erste vollautomatische System zur Produktion von Multiproteinkomplexen (ACEMBL) entwickelt. Bei diesem kann jeder Einzelschritt – vom Zusammenbau der Gene in Multigen-Vektoren bis hin zur Aufreinigung der rekombinant produzierten Proteinkomplexe – von Robotern ausgeführt werden. (Nature Methods 2009, 6: 447-50).

Bei herkömmlichen Methoden integriert man Gene mit Restriktionsenzymen und Ligasen in Plasmide. Diese Verfahren lassen sich jedoch schwer automatisieren, da für jede einzelne Gen-Integration oft ein anderes Sortiment von Restriktionsenzymen nötig ist. Im Gegensatz dazu basiert ACEMBL auf nur einem einzigen enzymatischen Schritt, der bei jeder beliebigen Gen-Integration gleich und deshalb automatisierbar ist. Jedes einzelne der speziell entwickelten ACEMBL-Plasmidmodule kann so mit einem oder mehreren Genen bestückt werden. Ein zusätzlich auf jedem Plasmidmodul vorhandener DNA-Abschnitt (LoxP) ermöglicht darüber hinaus die Verknüpfung von mehreren DNA-Plasmidmodulen. Hierzu genügt ein einfacher enzymatischer Schritt, den die Cre-Rekombinase übernimmt. Die resultierenden Multigen-Expressionsvektoren schleust man dann in E. coli-Wirtszellen zur Produktion der kodierten Multiproteinkomplexe ein. Auch die Kultivierung der E. coli-Zellen, deren Aufschluss sowie die Gewinnung der Proteinkomplexe durch Affinitätsreinigung übernimmt der Roboter. Weil man dabei mit sehr kleinen Volumina von einigen Millilitern arbeitet, kann man zahlreiche Experimente parallel ausführen (Details zur Expression von Multiprotein­komplexen mit ACEMBL finden Sie in unserem Nature Methods-Paper).

Wir haben mit Hilfe von ACEMBL bereits zahlreiche Proteinkomplexe exprimiert, darunter auch große, erstmals hergestellte Membranproteinkomplexe. Letztere sind als Zielorte vieler Wirkstoffe insbesondere für die Pharmaindustrie interessant.

Die erste Version von ACEMBL ist noch auf die Expression in E.coli beschränkt. Die Produktion von wichtigen menschlichen Proteinkomplexen ist in Prokaryoten wie E.coli jedoch oft nicht möglich. Wir arbeiten deshalb intensiv daran, das ACEMBL-System auch für eukaryotische Wirtszellen zu etablieren. Dies könnte in naher Zukunft die systematische Erforschung vieler wichtiger Proteinkomplexe mit Hilfe von Robotern auch in menschlichen Zellen ermöglichen.

Imre Berger & Michel Steinmetz






Letzte Änderungen: 09.09.2009