Tipp 147:
Protein-Extraktion

Mit der GTPC-Methode extrahieren Biologen Nukleinsäuren und Proteine schon seit über 20 Jahren. Aber auch diese Technik läßt sich noch verbessern.

Nach dem Motto „Zwei Fliegen mit einer Klappe schlagen“ suchten wir nach einer Methode, mit der man in einem Aufwasch RNA, DNA und Proteine aus dem gleichen Probenmaterial isolieren kann. Eines der hierzu verwendeten Verfahren ist die von Chomczynski und Sacchi entwickelte Guanidiniumisothiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion (GTPC, Analytical Biochemistry 1987, 162:156-159). Die GTPC-Extraktion bezeichnet man häufig als Trizol-Extraktion, auch wenn dazu andere kommerzielle Lösungen als Trizol verwendet werden.

Die GTPC-Extraktion beruht auf den unterschiedlichen Löslichkeiten der zu extrahierenden Substanzen in einem Monophasen-System, bei dem die verschiedenen Makromoleküle in unterschiedlichen Schichten zu finden sind. Proteine sammeln sich in der Phenol-Chloroform-Phase, die DNA befindet sich in der Interphase und die RNA in der oberen wässrigen Phase. Nach der Trennung der beiden Phasen fällt man RNA beziehungsweise DNA mit Isopropanol oder Ethanol und präzipitiert die Proteine in der Ethanol-Phenol-Phase mit Isopropanol. Die GTPC-Extraktion liefert meist gute Ergebnisse bei der RNA und DNA-Extraktion, die Proteinfällung ist jedoch zeitintensiv und die Proteinausbeute ist mit etwa 60 % gering.

Der kritische Schritt bei der Isolierung von Proteinen mit der GTPC-Methode ist die Löslichkeit des Pellets. Wir haben einige der hierzu verwendeten Lösungsmittel und Methoden getestet, aber die Pellets ließen sich immer nur unvollständig auflösen. Deshalb entwickelten wir eine verbesserte Methode mit der man zunächst RNA- und DNA und daran anschließend Proteine extrahieren kann (Chey et al. Anal. Biochem. 2011, 411: 164-6).

Die meisten Proteine sind wasserlöslich. Mischt man wasserlösliche organische Lösungsmittel wie Methanol oder Ethanol mit Wasser, interagieren Wasser- und Alkoholmoleküle über Wasserstoffbrückenbindungen und setzen die Dielektrizitätskonstante und die Solvatationskraft des Wassers für gelöste Proteine herab. Wessel und Flügge (Anal. Biochem. 1984, 138:141-3) benutzten deshalb ein Methanol-Chloroform-Wasser-Gemisch mit definierten Verhältnissen für die Präzipitation von Proteinen aus einer verdünnten wässrigen Lösung. Auf dieser Idee aufbauend, veränderten wir das GTPC-Protokoll und adaptierten es für die Protein-Isolation aus der Phenol-Ethanol-Phase. Entscheidend ist der Zusatz von Ethanol und Bromchlorpropan, die nach der GTPC-Extraktion, zur Fällung der Proteine in der Phenol-Ethanol-Phase eingesetzt werden.

Die Methode ist schnell und unkompliziert und kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Konkret sieht das Protokoll wie folgt aus:

• Zu einem Volumen proteinhaltiger Lösung (300 µl der Phenol-Ethanol-Phase) gibt man ca. 2,5 Volumen organisches Lösungsmittel (750 µl 100 % Ethanol) und schüttelt die Proben für 15 Sekunden mit einem Vortexer.
• Anschließend versetzt man die entstandene Suspension mit 200 µl Bromochloropropan und vortext erneut.
• Nachfolgend pipettiert man 600 µl bidestilliertes Wasser in die Suspension und mischt den Ansatz wieder auf dem Vortexer.
• Um die Phasen zu trennen, zentrifugiert man die Probe für fünf Minuten bei 12.000 g.
• Den oberen farblosen wässrigen Überstand entfernt man (die Proteine befinden sich in der Interphase).
• In die untere Phase und die Interphase gibt man 1 ml 100 % Ethanol und vortext erneut.
• Anschließend zentrifugiert man die Probe für fünf Minuten bei 12.000 g.
• Den Ethanolüberstand nimmt man vorsichtig ab und wäscht das Pellet einmal mit 1 ml 100 % Ethanol, vortext wieder und zentrifugiert dann fünf Minuten bei 12.000 g.
• Das Protein-Pellet trocknet man kurz an der Luft oder in einem leichten Vakuum.
• Durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit der Pipette in 4 % SDS löst man das Protein. Erhitzt man die Protein-Lösung auf 55 °C bis 60 °C, verbessert sich die Lösbarkeit. Die Proteinlösung kann man sofort verwenden oder bei -20 °C lagern.

Die verbesserte Proteinextraktions-Methode funktioniert bei Zellen und Geweben, die Ausbeute der gewonnenen Proteine liegt bei 95 %.

Soroth Chey
(Institut für Virologie, Universität Leipzig)



Letzte Änderungen: 29.04.2011