Gradienten-Gele gießen ist ziemlich tricky und geht schon mal daneben. Viel einfacher ist die Herstellung von Stufen-Gelen, die als Alternative eingesetzt werden können.
Bei unseren Versuchen im nephrologischen Forschungslabor der Universitätsklinik Erlangen müssen wir immer wieder Proteine mit sehr unterschiedlichen Größen in einem Zellhomogenat mittels Westernblot detektieren. Die Trennung der Proteine lässt sich mit zwei SDS-Polyacrylamidgelen oder mit einem Gradienten-Gel bewerkstelligen.
Die Herstellung von Gradienten-Gelen ist aber ziemlich aufwendig und gelingt, wenn sie nicht routinemäßig im Labor etabliert ist, auch nicht immer auf Anhieb. Eine Alternative sind kommerziell vorgefertigte Gradienten-Gele die jedoch nicht ganz billig sind.
Wir verwenden deshalb Stufen-Gele, um Proteine mit sehr unterschiedlichen Größen voneinander zu trennen. Hierzu gießen wir ein halbes Standard-Gel mit 15% Polyacrylamid und überschichten es mit Isopropanol. Nachdem das Gel auspolymerisiert ist, gießen wir die obere Hälfte mit 8% Polyacrylamid. Zum Schluss fügen wir das 4%ige Sammelgel hinzu. Die Elektrophorese führen wir unter Standardbedingungen durch, in unserem Fall sind dies zwei Stunden bei 120 V und 25 mA.
Beispiel eines Stufen-Gels. Das SDS-Gel wurde mit 25 µg eines Homogenats beladen, das aus Rac-Inhibitor (Rac-I)-behandelten Epithelzellen gewonnen wurde. Bild: AG Goppelt-Struebe
Je nachdem, welche Proteine man detektieren will, kann man den oberen und unteren Teil des Geles anschließend auf verschiedene Membranen blotten, in unserem Beispiel auf Nitrocellulose- und PVDF-Membranen. Beide Teile des Blots werden dann unter optimalen Bedingungen detektiert.
Die Darstellung des mitgeblotteten Markers in der obenstehenden Abbildung zeigt, dass sowohl die niedermolekularen, als auch die hochmolekularen Proteine gut aufgetrennt wurden. Stufen-Gele sind somit eine einfache und kostengünstige Alternative zu Gradienten-Gelen.
Margot Rehm,
Astrid Ebenau-Eggers,
Margarete Goppelt-Struebe